Caracterización antigénica y diseño de vacunas frente a la nueva variante del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo

Abstract

El conejo europeo (Oryctolagus cuniculus) es una especie clave en la península Ibérica debido a su importancia ecológica y económica. La enfermedad hemorrágica del conejo (RHD) es una de las principales patologías víricas que afecta a esta especie animal. El agente etiológico es el virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV), especie tipo del género Lagovirus, perteneciente a la familia Caliciviridae. La nueva variante de RHDV (RHDVb o RHDV2) se describió en España en 2011, causando la muerte de conejos jóvenes, y adultos previamente vacunados, sugiriendo diferencias antigénicas con respecto al virus clásico. La cápsida viral está formada por una proteína mayoritaria (VP1 o VP60) y la proteína minoritaria (VP2 o VP10). Basándose en análisis estructurales la proteína VP1 se divide en dos dominios principales: un dominio interno o “shell” (S), y un dominio externo o protruyente (P). El dominio P también se divide en dos subdominios, P1 y P2. La región más externa del dominio P (P2) contiene lazos expuestos hacia la superficie exterior de la cápsida viral. Esos lazos podrían estar implicados en la unión a los receptores celulares y en la diversidad antigénica del virus. Las vacunas disponibles frente al virus clásico no protegen o lo hacen parcialmente frente a la nueva variante. Por tanto, para detener las elevadas pérdidas económicas y ecológicas causadas por RHDVb se requiere el diseño de nuevas herramientas diagnósticas y vacunas para un mejor control de esta enfermedad. Para abordar este objetivo se llevó a cabo la caracterización antigénica de la proteína VP1 de RHDVb, mediante la producción de anticuerpos monoclonales frente a VLPs pertenecientes a dos tipos de RHDV. En esta tesis se ha demostrado que el epítopo del anticuerpo 2D9 se localiza en el dominio P y que la conformación tridimensional de los lazos expuestos en la superficie de este dominio es determinante para la unión del anticuerpo. La importancia del monoclonal 2D9 radica en su especificidad frente a RHDVb y en su capacidad de neutralizar al virus. Por otro lado, el anticuerpo 3A10 reconoce también a los virus clásicos RHDV-G1 y RHDV-G6 (RHDVa). Basándose en los anticuerpos monoclonales 2D9 y 3A10, se desarrollaron herramientas diagnósticas para la detección específica de RHDVb. El diseño de vacunas frente a la nueva variante se ha abordado de distintas formas, empleando antígenos con distinto grado de complejidad, así como diferentes sistemas de producción y administración de los mismos. 1) un péptido sintético basado en el lazo 1 del subdominio P2 de RHDVb fusionado con la proteína KLH. 2) lactobacilos recombinantes que expresan dominios P de diferentes tipos de RHDV, anclados a la pared o secretados, para su administración como vacuna oral viva. 3) una proteína de fusión GST-dominio P de RHDVb para su uso como una posible vacuna marcada. 4) VLPs de RHDVb producidas en distintos sistemas de cultivos celulares de insecto o crisálidas infectados con baculovirus recombinantes. La eficacia de todos estos antígenos y sistemas se analizó en ensayos de inmunización y desafío con RHDVb. Los datos obtenidos indican que un péptido sintético basado en el lazo 1 del subdominio P2 de RHDVb no protegió ni indujo la producción de anticuerpos detectables. Resultados similares se obtuvieron con la vacuna oral viva basada en lactobacilos recombinantes que expresan dominios P anclados a la pared. La proteína de fusión GST-dominio P, empleando una dosis de 100 µg/animal, permitió alcanzar una tasa de supervivencia del 50 % y los animales supervivientes mostraban anticuerpos frente a RHDVb. La administración de VLPs de RHDVb (5 y 100 µg/animal con adyuvante) protegió al 100 % de los conejos de la infección por RHDVb. Resultados similares se obtuvieron en la vacunación con 20 µg/animal de extractos de crisálidas que contenían VLPs de RHDVb en presencia de adyuvante. Los resultados presentados en esta tesis aportan un mayor conocimiento sobre las características antigénicas de la proteína VP1 y, junto con las distintas estrategias vacunales probadas, aportan información relevante para la generación de nuevas vacunas efectivas frente a RHDVb.