Estudio de la función del sistema zinc-metalotioneína en el ojo humano empleando metodologías bioanalíticas basadas en espectrometría de masas y biología celular

Abstract

El ojo humano, órgano altamente especializado y responsable del proceso de fotorrecepción, está constantemente sometido a estrés oxidativo originado por diversos factores entre los que se incluyen la exposición diaria a la radiación ultravioleta y un entorno altamente oxidativo. El daño oxidativo afecta a todas las estructuras oculares y es minimizado por la presencia de una gran variedad de antioxidantes que requieren de metales como cofactores para el desarrollo de sus funciones. Sin embargo, durante el envejecimiento estos sistemas antioxidantes pierden parte de su eficacia y el daño oxidativo contribuye a la patogénesis de enfermedades oculares. Un sistema antioxidante de interés creciente en el ojo es el complejo redox zinc-metalotioneína (Zn-MT), que es capaz de capturar y neutralizar los radicales libres a través de los ligandos de azufre de los residuos de cisteína de las MTs. Sin embargo, las metodologías convencionales no son suficientemente sensibles y específicas para llevar a cabo el estudio de su papel protector antioxidante. Por lo tanto, el desarrollo y aplicación de potentes técnicas híbridas basadas en espectrometría de masas puede ayudar a mejorar el entendimiento del sistema Zn-MT en el globo ocular. De este modo, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral ha consistido en el estudio de la función del sistema antioxidante Zn-MT en el ojo humano mediante técnicas bioanalíticas basadas en espectrometría de masas y biología celular. En el primer capítulo se llevó a cabo un estudio multidisciplinar que aborda la especiación cuantitativa de Zn, Fe y Cu en el cristalino y la caracterización del sistema Zn-MTs en un modelo in vitro de células epiteliales del cristalino (HLEsv). Mediante la combinación de espectrometría de masas e isótopos estables enriquecidos se obtuvieron altos niveles de Zn tanto en el cristalino descapsulado como en las células epiteliales adheridas a la cápsula, observándose una unión preferencial del Zn a proteínas de baja masa molecular. Además, se desarrolló una metodología de ablación láser (LA) acoplada a espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) para obtener imágenes de distribución elemental de Zn, Fe y Cu en cristalino, cuyos resultados confirmaron nuestras observaciones previas. Por otro lado, se estudió el sistema Zn-MT y la expresión de MTs en las células HLEsv, observándose que tanto el tratamiento con 68ZnSO4 como con interleucina dieron lugar a una fuerte inducción en la expresión de las MTs y provocando cambios estequiométricos a la forma más saturada (Zn7-MT). En el segundo capítulo se aplicaron las metodologías desarrolladas anteriormente e introdujeron algunas variaciones para el estudio de especiación cuantitativa de Zn, Fe y Cu en la retina y en el epitelio pigmentario de la retina (EPR), observando una unión preferencial de Zn a proteínas de baja masa molecular en el EPR. Además, se desarrolló una metodología basada en LA-ICP-MS para obtener imágenes cuantitativas de Zn en secciones oculares humanas de la zona de la retina, observándose una localización específica del Zn en el EPR. Por otro lado, se estudió el sistema Zn-MT en un modelo in vitro de células del EPR (HRPEsv), concluyéndose que el tratamiento con 100 µM 68ZnSO4 dio lugar a los mayores niveles de MTs y a la forma más saturada (Zn7MT). En el tercer capítulo se estudió el papel protector del sistema Zn-MT frente al estrés oxidativo, dependiente del número de iones metálicos unidos a los residuos de cisteína de las MTs. Para ello, se utilizó el modelo celular HRPEsv en el que se indujo el ciclo redox Zn-MT mediante el tratamiento previo con sulfato de Zn y se emplearon diferentes estresores y dos sondas fluorescentes para la cuantificación relativa de las especies reactivas de oxígeno. Se observó que el zinc regula la síntesis del sistema Zn-MT y este y reduce significativamente los niveles de estrés oxidativo en el modelo celular HRPEsv in vitro. En el cuarto capítulo se llevó a cabo la evaluación de la absorción de Zn en dos formas fisicoquímicas enriquecidas isotópicamente, en un modelo in vitro de células de HRPEsv. Se empleó la herramienta matemática de deconvolución de perfiles isotópicos (IPD) en combinación con ICP-MS para diferenciar la contribución de Zn endógeno y exógeno proveniente de cada tratamiento. Además, se desarrolló una metodología de IPD-LA-ICP-MS para obtener imágenes de fracciones molares y estudiar la distribución de Zn suplementado en cada célula individual. Bajo las condiciones experimentales establecidas, se observó una localización preferencial del Zn en el núcleo celular, sin diferencias en la absorción según los tratamientos estudiados.