Caracterización de conjugados de proteínas y nanopartículas metálicas mediante el empleo de técnicas complementarias de espectrometría de masas y de microscopía

Abstract

La nanotecnología es uno de los campos de conocimiento emergentes, cuya evolución es cada vez más relevante, gracias a los continuos avances científicos y tecnológicos. A pesar de todas las ventajas que muestra y el futuro aún más prometedor que presenta, también se deben de tener en cuenta el impacto que los nanomateriales van a ocasionar al interaccionar con medios biológicos. Cuando las nanopartículas entran en contacto con un medio biológico, inmediatamente tendrá lugar la competición entre las diferentes biomoléculas presentes en dicho medio (proteínas, lípidos, etc.) para ser adsorbidas sobre la superficie de las nanopartículas. Esta interacción da lugar a la formación de una corona proteica, conocida como “Protein Corona”. Dicha corona es la que le va a conferir una nueva identidad biológica a la nanopartícula. Por tanto, es importante profundizar en el estudio de dicha identidad biológica ya que será la que va a determinar el destino y el impacto biológico de las nanopartículas. En este sentido, se utilizarán diferentes métodos analíticos para la determinación de nanopartículas de oro (AuNPs) en sistemas biológicos y el análisis, caracterización e identificación de los bioconjugados formados por las NPs y la capa de proteínas que los recubren, al interaccionar con diferentes medios biológicos, suero, en cultivos celulares o al ser administradas vía intraperitoneal y extraídas de un tejido. Para este fin, se emplearán técnicas híbridas basadas principalmente en espectrometría de masas. Técnicas como espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) y espectrometría de masas de desorción e ionización por láser asistida por matriz (MALDI-MS) para el análisis cualitativo, y para el análisis cuantitativo la espectrometría de masas de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS). Además, se utilizarán técnicas de microscopía electrónica (HR-TEM) para la caracterización de las nanopartículas. Los estudios realizados se han centrado en la puesta a punto de una metodología de preparación de la muestra adecuada, purificación y extracción de los bioconjugados para su posterior análisis. Los resultados más importantes se resumen a continuación: • La síntesis y caracterización de nanoclusters (AuNCs y AgNCs) mediante diversas técnicas analíticas. Puesta a punto de la metodología necesaria para la separación (HPLC-Vis/UV) y caracterización mediante diferentes técnicas de espectrometría de masas (ICP-MS, ESI-MS y MALDI-MS) para el análisis cualitativo de estas nanopartículas. Los Au9BSA nanoclusters sintetizados y caracterizados, muestran una excelente capacidad para determinar la actividad de proteasas, como por ejemplo, la tripsina. • Estudio de la interacción entre las AuNPs y las proteínas presentes en distintos medios biológicos. Todos los experimentos realizados han dado lugar al desarrollo de una estrategia analítica para el análisis de los bioconjugados proteínas-NPs. Se ha desarrollado un método de purificación basado en la centrifugación, el cual permite separar las proteínas que están unidas a las NPs, de las que permanecen libres en disolución. Esta estrategia permite la identificación y cuantificación de las proteínas que componen la corona. En el estudio con muestras de suero humano, por ejemplo, se observó que al aumentar el tamaño de las AuNPs, el número de proteínas adsorbidas en su superficie disminuye. En el caso de los cultivos celulares, la caracterización se realizó mediante una técnica de marcaje isotópico (SILAC). Este estudio reveló alteraciones en la expresión de diversas proteínas, debido a la interacción con las AuNPs de dos tamaños diferentes.