Desarrollo de nuevas estrategias analíticas basadas en el empleo de técnicas de espectrometría de masas para la determinación de biomarcadores de estrés oxidativo en fluidos biológicos

Abstract

La necesidad de monitorizar los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el organismo, tanto en la investigación biomédica básica como para el diagnóstico clínico y la prevención de ciertas enfermedades (cardiovasculares, cáncer, neurodegenerativas, etc.) de gran incidencia social y cuyas patologías están relacionadas con el estrés oxidativo, ha originado un creciente interés en el desarrollo de estrategias analíticas que permitan la determinación de biomarcadores del mismo, como importantes herramientas en el estudio de dichas patologías. En la actualidad, la monitorización de enzimas antioxidantes como biomarcadores de estrés oxidativo se lleva a cabo, principalmente, mediante la medida de los cambios en su actividad enzimática utilizando las técnicas convencionales (ensayos enzimáticos espectrofotométricos). Por otro lado, la determinación de aminotioles se suele llevar a cabo mediante técnicas cromatográficas con detección VIS-UV o fluorescente y mediante técnicas de LC-MS. Sin embargo, todas estas técnicas presentan una serie de limitaciones y, por lo tanto, parece clara la necesidad de desarrollar metodologías alternativas con mejores prestaciones analíticas y capaces de proporcionar información estructural y cuantitativa. En este sentido, las técnicas de espectrometría de masas (molecular y elemental) presentan un enorme potencial para el análisis de biomoléculas en general y, en particular, para aquellas que puedan ser útiles como biomarcadores. Así pues, el objetivo general de la presente tesis doctoral fue la puesta a punto de metodologías analíticas innovadoras basadas en técnicas de espectrometría de masas para la determinación de biomarcadores de estrés oxidativo. Este objetivo general se abordó a través de los siguientes objetivos específicos: - Puesta a punto de una estrategia analítica para la determinación simultánea de la concentración y la actividad de la enzima glutatión peroxidasa en eritrocitos mediante HPLC con detección específica de selenio por ICP-MS y cuantificación mediante dilución isotópica post-columna. • Puesta a punto de una estrategia analítica para la determinación simultánea de la concentración y la actividad de la enzima glutatión peroxidasa en eritrocitos mediante HPLC con detección específica de selenio por ICP-MS y cuantificación mediante dilución isotópica post-columna. • Evaluación del potencial de la enzima superóxido dismutasa como biomarcador de estrés oxidativo en pacientes con enfermedades oculares mediante técnicas de análisis de HPLC-ICP-MS con dilución isotópica post-columna. • Desarrollo de una metodología de HPLC-ICP-MS con dilución isotópica post-columna de hierro para la cuantificación de la enzima catalasa en muestras de eritrocitos empaquetados. • Desarrollo de una nueva estrategia analítica basada en el empleo del compuesto auranofin como sonda de actividad, para la determinación de la forma activa e inactiva de la enzima tiorredoxína reductasa en suero mediante HPLC-ICP-MS con detección específica de selenio y oro. • Puesta a punto de una metodología de HPLC-ICP-MS con dilución isotópica post-columna para la determinación del contenido de homocisteína libre en suero, mediante la utilización del compuesto ebselen como reactivo derivatizante.