Determinación indirecta de gluten mediante métodos basados en la detección de ADN : PCR y genosensores electroquímicos

Abstract

La enfermedad celíaca es una enteropatía autoinmune muy frecuente (1% de la población) que se produce en individuos genéticamente predispuestos como resultado de una respuesta inmune exacerbada contra un factor ambiental bien definido, el gluten. De esta forma, es importante que los enfermos celíacos no consuman alimentos que contienen gluten. Además, parece que el consumo de cantidades relativamente pequeñas de gluten durante largos períodos de tiempo se correlaciona con un aumento del riesgo de desarrollo de complicaciones de tipo autoinmune.Por lo tanto, la identificación de la presencia de gluten y su cuantificación en productos alimenticios son de primordial importancia, a la vez que un reto para los científicos, debido a la dificultad de su análisis. Hoy en día, la verificación analítica del cumplimiento de los requisitos de etiquetado y de detección de trigo en los productos alimenticios se realiza principalmente por métodos que detectan proteínas tipo inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA). Sin embargo, a pesar de los enormes avances en la detección de proteínas de gluten, algunas de las limitaciones de los métodos existentes han fomentado el desarrollo de tecnologías alternativas. Así, los métodos basados en el ADN, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR en tiempo real o los sensores de ADN (también denominados genosensores), representan opciones atractivas. Todos ellos comparten una ventaja significativa: el analito en sí se puede amplificar y, por lo tanto, se pueden detectar cantidades extremadamente bajas del mismo. También la mayor estabilidad de las moléculas de ADN, en comparación con las proteínas, los hace métodos muy convenientes, especialmente para su aplicación al análisis de alimentos procesados. Sin embargo, la enorme complejidad del genoma del trigo (probablemente el más complejo de las especies vegetales domesticadas), junto con su gran variabilidad genética lo convierten en una tarea desafiante a la vez que de enorme interés. En general, los métodos basados en la detección de ADN se utilizan principalmente como herramientas de cribado para detectar la presencia de alimentos alergénicos, pero la PCR y los genosensores ofrecen una alternativa de alta sensibilidad y especificidad frente a los métodos ELISA, también con fines de cuantificación. Además, los métodos ELISA y PCR analizan diferentes tipos de analitos, de modo que un resultado positivo en ambos ensayos representa una evidencia casi absoluta de que el alérgeno está presente.Debido a las ventajas de los métodos de ADN para la detección de trigo en alimentos, en la última década han surgido varios métodos de PCR y PCR en tiempo real, aunque la mayoría no alcanzan la sensibilidad necesaria. Una alternativa más sencilla y económica la constituyen los biosensores. Además de los métodos de PCR, los genosensores o sensores de ADN, en especial los genosensores electroquímicos, son una alternativa en la detección de ADN por su relativa simplicidad, bajo coste de la instrumentación, la posibilidad del análisis en línea, o diseño de equipos miniaturizados y portátiles. Sin embargo su aplicación para la detección de trigo en alimentos está sin explotar. La Tesis Doctoral se centra en la detección indirecta de gluten empleando secuencias de ADN específicas de cereales dañinos para enfermos celiacos, como alternativa a los métodos de detección de proteínas. Se realizó una búsqueda de las secuencias de ADN relacionadas con los cereales tóxicos para los enfermos celíacos adecuadas para emplearlas como analito. Se caracterizó ampliamente el comportamiento de tres secuencias de ADN por PCR en tiempo real y se evaluaron críticamente, obteniéndose con todas ellas una sensibilidad notablemente superior a la mencionada en la literatura hasta el momento (<20 ppm), cumpliendo con los requisitos impuestos por la legislación vigente. Se constató una fuerte influencia de la matriz en los resultados obtenidos, siendo las matrices de arroz y maíz las que ofrecieron las mejores prestaciones analíticas. Este hallazgo apunta a la necesidad de adecuar la matriz de los patrones a la de la muestra para evitar desviaciones negativas o positivas del valor verdadero. La secuencia de oligonucleótidos que codifica el péptido inmunodominante de la gliadina fue la que suministró los mejores resultados, motivo por el cual se diseñó un genosensor electroquímico para su detección, el primero específicamente diseñado para el análisis de gluten. Al contrario que para el caso de otros genosensores electroquímicos, la detección de fragmentos amplificados por PCR de muestras reales se pudo realizar sin ningún tipo de purificación previa de los amplicones y permitió cuantificar 15 pg de ADN de trigo o 0.001% de trigo en matriz de arroz, una detectabilidad que rivaliza directamente con los métodos más sensibles de PCR en tiempo real. El genosensor permitió la determinación de ADN de todos los cereales tóxicos incluida la avena mientras que no mostró reactividad cruzada con otras especies seguras como arroz y soja. Para disponer de un método específico de trigo, la selectividad del sensor fue modificada mediante el uso de sondas estructuradas que permitieron la detección selectiva de trigo frente a otros cereales filogenéticamente relacionados (cebada, centeno, avena) sin comprometer en gran medida las características analíticas del genosensor diseñado. Por último se exploró el método de análisis de curvas de disociación de alta resolución (HRM de sus siglas en inglés, high resolution melting) para su aplicación en la identificación de cereales tóxicos, pudiéndose discriminar el tipo de cereal del que proviene el gluten presente en una muestra. En definitiva, los métodos propuestos en este trabajo, una vez caracterizados y optimizados, suponen un avance en la detección de gluten a través de secuencias de ADN específicas de trigo y constituyen sistemas pioneros en un campo que está aún por explorar, pero que tiene enormes posibilidades de desarrollo.