Nuevos métodos de detección de marcadores de estrés oxidativo en muestras biológicas

Abstract

El estrés oxidativo se define como un desbalance entre sustancias oxidantes y antioxidantes a favor de las primeras que conduce a una disrupción de la señal redox y del control y/o daño molecular. La célula, se encuentra expuesta a una gran variedad de especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno (EROs y ERNs) que son responsables de la generación de estrés oxidativo y pueden originar daños en diversas dianas biológicas como lípidos, ADN y proteínas. La continua exposición de la célula a varios tipos de estrés oxidativo ha llevado a todo el organismo a desarrollar sistemas de defensa para protegerse de moléculas reactivas. El creciente interés del estrés oxidativo en el campo biomédico ha llevado a estudiar la importancia de los mecanismos que permiten evaluar y cuantificar la participación de radicales libres en distintos eventos biológicos. Aunque en la literatura científica hay numerosas aplicaciones de distintas metodologías para su determinación, muchos de esos métodos se han mostrado ineficaces, poco sensible o requieren protocolos complejos y un equipamiento específico que no está disponible habitualmente. Esta tesis doctoral se centra de forma específica en el desarrollo de metodología adecuada para la cuantificación de marcadores de daño oxidativo así como en su aplicación a los accidentes cerebrovasculares isquémicos. Dentro de los marcadores de estrés oxidativo estudiados, se encuentran los F2-isoprostanos (8-epi PGF2¿). Estos son compuestos generados por la peroxidación no enzimática del ácido araquidónico la cual está catalizada por radicales libres. Están considerados como los mejores biomarcadores de estrés oxidativo y peroxidación lipídica ¿in vivo¿. Otros ácidos grasos también son oxidados como consecuencia del daño oxidativo y por tanto pueden ser usados como marcadores de dicha patología. Dos de los ácidos grasos más importantes son el ácido docosahexaenoico (DHA) y el ácido eicosapentaenoico (EPA) que fueron estudiados en este trabajo de investigación. El daño lipídico altera y modifica las membranas celulares y por tanto la función celular, siendo necesario el estudio de marcadores de peroxidación lipídica. A pesar de que existen varios métodos para su determinación, en nuestro estudio se midió la concentración de moléculas generadas durante la lipoperoxidación como MDA y HNE. El sistema de defensa antioxidante de la célula es muy extenso y se encuentra dividido en un sistema enzimático de defensa antioxidante y en una serie de moléculas antioxidantes de bajo peso molecular. En el presente trabajo de tesis doctoral se aborda la determinación y medida de un elemento presente en el sistema enzimático de defensa antioxidante como es la forma reducida del tripéptido glutatión, GSH, así como de diversas moléculas antioxidantes de bajo peso molecular esenciales para la célula como la vitamina E (¿-D-tocoferol) y la vitamina C (ácido ascórbico). Como complemento a estos parámetros estudiados, se realizó el análisis de la capacidad antioxidante total ya que esta es una medida general mucho más precisa e indicativa del estado antioxidante, reflejando la actuación de todas las moléculas antioxidantes presentes en la muestra y no sólo la de una molécula específica. Adicionalmente a los métodos expuestos, se desarrolla un método para la determinación del volumen celular con el objetivo de obtener datos exactos de concentraciones intracelulares de los distintos antioxidantes endógenos y exógenos antes mencionados. Tras realizar el desarrollo y la puesta a punto de los métodos de medida de estrés oxidativo y con el objeto de valorar su posible aplicación biomédica, se desarrolló un estudio comparativo entre sujetos controles y pacientes que habían sufrido un accidente cerebrovascular isquémico, en términos de estrés oxidativo. En la comparación de los parámetros bioquímicos, se observaron diferencias significativas en los niveles de sodio, glucosa, urea y proteína C reactiva entre ambos grupos. En el caso de los parámetros de estrés oxidativo tanto la vitamina E como la vitamina C muestran una bajada significativa en los pacientes tras el accidente cerebrovascular, mientras que parámetros que denotan aumento de estrés como el LPO y los isoprostanos aparecieron incrementados en este tipo de pacientes. El resto de parámetros analizados no mostraron diferencias significativas entre ambos grupos excepto el DHA que se vio aumentado en el grupo de los controles. Por último, con objeto de establecer un modelo predictivo que nos indicase la evolución de los pacientes, se llevó a cabo un trabajo estadístico con los datos obtenidos. Primero se realizó un estudio de componentes principales para reducir el número de variables de estrés oxidativo a 4 componentes principales, cuya combinación desembocó en un dendograma capaz de discriminar entre dos grupos de pacientes con distinto pronóstico tres días después del accidente cerebrovascular. Se realizó así mismo un análisis ROC que demostró la eficacia predictiva tanto de la vitamina C como de la LPO en pacientes 72h tras sufrir el ictus isquémico. Obteniendo por tanto una herramienta predictiva para esta enfermedad.