Diseño de un sistema múltiple de detección y cuantificación de patógenos de transmisión alimentaria

Abstract

Las enfermedades de transmisión alimentaria son aquellas de naturaleza infecciosa o toxigénica que han sido causadas por el agua o los alimentos. Se estima que alrededor del 30% de la población mundial las padece cada año y aunque no suelen ser mortales, pueden ser bastante incapacitantes. Así mismo se generan elevados costes económicos producto de bajas laborales, mercancía inmovilizada y análisis de lotes de alimentos. La higiene y la seguridad microbiológica de los alimentos están convenientemente reguladas por varias normas y reglamentos, los cuales establecen los límites de tolerancia para los patógenos causantes de estas enfermedades, como son: B. cereus, C. jejuni, C. perfringens, C. sakazakii E. coli, la familia Enterobactericeae, L. monocytogenes, Salmonella spp, Shigella spp y S. aureus. Habitualmente en la industria alimentaria y los laboratorios de análisis se recurre a la detección y cuantificación de estos microorganismos mediante técnicas basadas en la microbiología clásicas, las cuales requieren una inversión de tiempo elevada y generan resultados en tiempos que van desde 24 horas hasta varios días. Los métodos basados en genética molecular se presentan como una alternativa rápida, sencilla y eficaz para llevar a cabo la misma tarea. En este trabajo se han diseñado dos métodos, uno para la detección simultánea de ocho especies, dos géneros y una familia de microorganismos patógenos de origen alimentario, mediante PCR multiplex; y otro para la cuantificación de cuatro especies y una familia de microorganismos patógenos de transmisión alimentaria mediante qRTi-PCR. Para el primero han sido seleccionadas dianas genéticas conservadas y específicas para cada microorganismo, sobre las cuales se han diseñado parejas de cebadores que han sido evaluados tanto en modo uniplex, como en modo múltiplex, obteniéndose amplificación simultánea y reproducible de las siete especies, dos géneros y una familia de patógenos. Para el segundo método se han escogido dianas para cada microorganismo, a partir de las cuales se han diseñado parejas de cebadores y sondas TaqMan, que han sido ensayadas en modo uniplex y dúplex, obteniéndose amplificación positiva en cada caso para cada microorganismo. Para evitar la aparición de falsos resultados negativos se ha diseñado un control interno de amplificación quimérico (QIAC), el cual consiste en una secuencia de ADN heteróloga flanqueda por las secuencias de hibridación de las parejas de cebadores. Para este control interno se diseñó una sonda específica con tres versiones, marcadas con fluoróforos diferentes de tal forma de que la misma pueda ser usada en todas las combinaciones posibles. Se llevaron a cabo reacciones de qRTi-PCR incluyendo el QIAC en las que se obtuvo amplificación y señal de todas las sondas presentes. Adicionalmente, para eliminar la amplificación de ADNg proveniente de células no viables, se optimizó un método basado en un agente intercalante del ADN, el EMA; el cual inhibe la amplificación del ADN de células con estas características. La aplicación del mismo ha permitido observar un aumento del Ct respecto aquellas muestras en las cuales no se ha aplicado. Ambos métodos han sido validados respecto al método clásico con cinco tipos de matrices alimentarias: cárnicos, pescado, preparados, pastelería y lácteos. La misma ha mostrado porcentajes de coincidencia entre métodos de hasta el 92%, cuando se comparan le método clásico y el de mPCR. Para el caso de la qRTi-PCR, se han obtenido diferencias entre las medias de ambos métodos y una baja correlación entre ellos, mientras que se ha demostrado la capacidad de generar datos homogéneos del método de qRTi-PCR, lo que se evidencia en valores altos del coeficiente de correlación e igualdad de medias.