Control analítico de síntesis, solubilización y funcionalización de nanopartículas (quantum dots) mediante ICP-MS para la cuantificación absoluta de proteínas

Abstract

Los Quantum Dots (QDs) son nanocristales semiconductores fotoluminiscentes cuyo tamaño oscila en un rango de 1-12 nm y generalmente están constituidos por elementos pertenecientes a los grupos 12-16, 13-15 ó 14-16 de la Tabla Periódica. Debido a efectos de confinamiento cuántico, QDs poseen unas propiedades ópticas y electrónicas especiales por lo que han sido ampliamente estudiados y aplicados en los últimos años. De entre todas ellas, su propiedad más característica reside en la posibilidad de modular su emisión de fluorescencia con tan solo modificar su composición y, sobre todo, su tamaño. Entre todos los tipos de QDs, los compuestos por un núcleo de CdS y CdSe han sido los más empleados como fluoróforos en aplicaciones analíticas hasta la fecha. Su capacidad para ser bioconjugadas a biomoléculas específicas, convierten a los QDs en nanopartículas muy atractivas en una gran variedad de investigaciones bioanalíticas. Particularmente en la última década los QDs se han utilizado con frecuencia en el desarrollo de inmunosensores e inmunoensayos en diferentes formatos. Sin embargo, tales métodos basados en QDs todavía no son muy fiables para medidas cuantitativas. De hecho, el potencial analítico de QDs para su empleo como ¿marcas¿ para el análisis cuantitativo de biomoléculas requiere el control analítico exhaustivo de los procesos básicos de síntesis así como de su solubilización y funcionalización. En este contexto, la presente Tesis Doctoral tiene como objetivo el desarrollo de metodologías analíticas para el control analítico de los procedimientos de síntesis, solubilización y funcionalización de QDs mediante el empleo de la Espectrometría de Masas Elemental (ICP-MS). Este objetivo general se abordó a través de tres objetivo parciales cuyas investigaciones se resumen a continuación: 1. Caracterización del contenido elemental de QDs de CdSe y CdSe/ZnS y su evolución a lo largo de la síntesis. En primer lugar, se empleó por primera vez el ICP-MS en combinación con el análisis por dilución isotópica como una herramienta analítica para determinar el contenido elemental de Cd y Se presentes por cada QD de CdSe/ZnS de manera exacta y precisa. La novedosa metodología desarrollada demostró que el ICP-MS puede desempeñar un papel importante para evaular los procedimientos de síntesis de QDs, ayudando a controlar las condiciones para producir nanopartículas bien definidas y reproducibles. La combinación de la información elemental (ICP-MS) y molecular (fluorescencia y absorción UV-Vis) ha permitido establecer el número de átomos de Cd y Se que existen por núcleo de QD, con una precisión y exactitud sin precedentes. 2. Desarrollo de una nueva estrategia elemental y molecular integrada para el control analítico de la solubilización y funcionalización a biomoléculas de QDs de CdSe y CdSe/ZnS. El ICP-MS en combinación con técnicas cromatográficas y de fluorescencia molecular, demostró ser una poderosa herramienta de diagnóstico para la caracterización y evaluación de la calidad de QDs solubilizados en fase acuosa. Esta estrategia ¿integrada¿ también permitió determinar la efectividad de la bioconjugación de QD a anticuerpos, mostrando que dicha integración entre la información elemental y molecular es fundamental para lograr una caracterización completa de los bioconjugados de QDs, un aspecto crítico para su futuro empleo en inmunoensayos cuantitativos. 3. Desarrollo de una herramienta genérica basada en QDs como marcas elementales en inmunoensayos para la cuantificación absoluta de proteínas con detección por ICP-MS. La prueba de concepto de una estrategia genérica basada en el empleo de CdSe/ZnS QDs como marcas elementales para la cuantificación absoluta de proteínas (transferrina) en inmunoensayos con detección por ICP-MS ha sido abordada. En esta estrategia, QDs modificados con estreptavidina (QDs-SAv), se bioconjugan a un anticuerpo secundario biotinilado (b-Ab2), por lo que esta plataforma genérica, permite la determinación sensible de cualquier proteína con tan solo cambiar el anticuerpo primario especifico de detección. Se evaluó críticamente el potencial de absorción UV-Vis, que es la técnica de detección de referencia, comparándola con las prestaciones analíticas que ofrece el ICP-MS (con la proteína transferrina como modelo). El ICP-MS ofreció un límite de detección absoluto un orden de magnitud inferior (por debajo de 230 amol para Tf) al conseguido por UV-Vis.