Caracterización de genes implicados en la biosíntesis de los azúcares del macrólido oleandomicina y su aplicación en la generación de azúcares

Abstract

En la presente tesis se describe la secuenciación y caracterización de los genes olev, olew, olel, oles, olee y oleu, demostrándose su implicación en la biosíntesis de dtdp-l-olivosa mediante la generación de los plásmidos polv y pole. Este último plásmido incluida el gen oley. Tras sobreexpresar dicho gen, se hicieron ensayos de actividad frente a distintos sustratos, concluyendo que la metiltransfersas oley actúa sobre el azúcar unido al aglicón. Este enzima ha sido purificado y caracterizado, concluyendo que actúa a un rango de ph restringido, que su forma nativa es dimérica,que requiere cationes para su buen funcionamiento y que es capaz de metilar l-micarosil-eritronólido b y l-ramnosil-eritronólido b. Los plásmidos polv y pole fueron introducios en una cepa de s. Lividans que incluía el cósmido cos16f4, obteniéndose los compuestos híbridos: l-olivosil-8-demetil-tetracenomicina c, l-oleandrosil-8-demetil-etracenomicina c, 2'-demetoxi-eloramicina y eloramicina. La obtención del último compuesto nos llevó a concluír que con los genes de biosíntesis de l-olivosa se podía generar el azúcar l-ramnosa, y para confirmarlo se constryó el plásmido prham. Por último en el trabajo se ha construído un plásmido de cassettes pln2 utilizando los genes de biosíntesis de l-oleandrosa. Este plásmido era capaz de generar 2,6 y 6 deoxiazúcares mediante intercambio, deleción y adición de genes pertenecientes a otros rutas de biosíntesis. En el trabajo se muestra la utilidad del plásmido para intercambiar genes pertenecientes a otras rutas de biosíntesis. En el trabajo se muestra la utilidad del plásmido para intercambiar genes codificadores de 4-cet-reductasas y la generación de un plásmido capaz de sintetizar dtdp-l-rodinosa.