Análisis bioquímico, genético y molecular de una carboxipeptidasa de la levadura de fisión schizosaccharomyces pombe

Abstract

En este trabajo abordamos la caracterización genética y bioquímica de una actividad carboxipeptidásica, denominada carboxipeptidasa ysps de la levadura de fisión schizosaccharomyces pombe que libera leucina de sustratos peptídicos tales como el sustrato cbz-gly-leu. Hemos purificado el enzima empleando distintos pasos cromatográficos y hemos descubierto que el enzima es un oligómero. El enzima muestra gran afinidad por la leucina en el extremo carboxilo terminal, siempre que el penúltimo aminoácido sea pequeño y sin carga. El valor de la km para los sustratos cbz-gly-leu, cbz-gly-gly-leu, cbz-ala-leu son de 6,7 mm, 6 mm y 20 mm, respectivamente. La carboxipeptidasa ysps pertenece al grupo de las metaloproteasas, como se deduce del comportamiento que muestra con distintos inhibidores típicos de proteasas y de iones metálicos. El enzima es una glicoproteina, con tres sitios potenciales de glicosilación, como se dedujo tras realizar distintas digestiones con endo h. Hemos obtenido anticuerpos que reconocen específicamente a la carboxipeptidasa ysps en un extracto crudo de la levadura de fisión. Mediante mutagénesis con ems, se aisló una cepa deficiente en actividad carboxipeptidásica que porta con una mutación cromosómica y recesiva, y afecta al gen estructural del enzima. También comenzamos la caracterización molecular de la carboxipeptidasa ysps y hemos aislado plásmidos recombinantes de una genoteca que son capaces de complementar la mutación previamente aislada.