Aplicación de la espectrometría de masas al control analítico (determinación y especiación) de elementos traza y azufre en fluídos biológicos

Abstract

El objetivo general de esta Tesis consistió en el desarrollo de metodologías analíticas híbridas, Cromatografía (HPLC, GC) - Espectrometría Atómica de Plasma (ICP-MS) y el empleo de la Espectrometría de Masas molecular (MALDI-TOF y GC-MS), para la caracterización y/o determinación de ciertos parámetros seleccionados de interés nutricional y clínico (elementos esenciales, tóxicos y homocisteína). La idea básica no es otra que investigar nuevas técnicas analíticas basadas en la detección específica de heteroátomos (metales, I y S), detectados por ICP-MS con gran especificidad, para el control analítico de tales parámetros en muestras biológicas. El trabajo realizado, persiguiendo objetivos específicos diseñados para llegar a dicho objetivo general ha permitido la consecución de los siguientes resultados y conclusiones de interés: 1. Desarrollo de un método para la determinación por ICP-MS del contenido total delos elementos esenciales y/o tóxicos: Fe, Cu, Se, Zn, I, Mn, Cr, Co, Al, Pb y Cd, en leche humana de madres de parto a término y de parto prematuro y estudio de su variación durante el periodo de lactancia (durante el primer mes. Tras la validación analítica, el método se aplicó a muestras de leche materna y a las leches fórmula. El análisis estadístico de los resultados obtenidos para Fe, Cu, Zn, Se y I, en el suero lácteo de leche humana en función de los días del periodo de lactancia muestra, en el caso del zinc y selenio, variaciones estadísticamente significativas en estos elementos a lo largo de la lactancia. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en la concentración en estos elementos en n función del periodo de gestación (e.g. madres con parto prematuro o a término). Al comparar los contenidos de elementos esenciales existentes en leche humana y los existentes leches fórmula se encontraron notables diferencias en los contenidos de hierro, selenio y yodo. En algunos casos (e.g. hierro) en que pueden aparecer contenidos especialmente elevados probablemente debida a una suplementación. 2.- Desarrollo de una metodología analítica para la especiación analítica de los elementos esenciales seleccionados, tanto en las muestras de leche como en las leches fórmula, utilizando el acoplamiento HPLC-ICP-MS. Las diferencias, estadísticamente significativas, encontradas en los perfiles elementales obtenidos en el análisis de suero de los diferentes tipos de leche en estudio (humana y fórmula) ponen de manifiesto que la biodisponibilidad (especiación química) de un determinado bioelemento puede ser completamente distinta en leche humana que en las leches fórmula analizadas. Este hecho tiene una especial importancia en el ámbito de la producción industrial de leches fórmula e indica la necesidad de disponer de información fiable sobre la naturaleza de las especies elementales (metal-biomoléculas) concretas presentes en la leche humana. Dicha información es básica para poder asegurar y fabricar leches fórmula pueden sustituir adecuadamente a la leche materna en la nutrición infantil. 3.- Desarrollo de métodos para purificación por cromatografía multidimensional de de la(s) proteína(s) presentes en una de las fracciones en las que eluyen el Fe,Cu y Zn, detectada por HPLC-MS ICP-MS.De este modo es posible la su identificación vía MALDI-TOF (por su peso molecular), así como la confirmación de la metal-biomolecula previa digestión enzimática y determinación del peso molecular de los peptidos (mass fingerprinting) identificados por MALDI-TOF. La capacidad de la técnica de espectrometría de masas moleculares MALDI-TOF para llevar a cabo la caracterización de tales proteínas ha sido demostrada aquí para identificar la a-lactalbúmina. 4.- Desarrollo de una metodología por la detección de S por Cromatografía de gases (CG) e ICP-MS de Doble Enfoque (DF). La técnica híbrida puesta a punto proporcionó unas características analíticas muy adecuadas (con unos límites de detección para azufre en el rango de unas pocas ppb) para llevar a cabo con éxito la especiación de aminoácidos de azufre en muestras biológicas. La aplicabilidad de la metodología CG-ICP-(DF)MS propuesta se ha evaluado para la determinación de homocisteína en suero sanguíneo humano. Los resultados obtenidos concuerdan bien con los valores en los que normalmente se encuentra la homocisteína en estas muestras y este resultado abre el camino a una aplicación futura de está técnica de gran robustez y sensibilidad a sueros de enfermos cardiovasulares (y de otros pacientes) con fines de diagnóstico.