Fraccionamiento y producción de proteínas y péptidos activos a partir de sueros lácteos y derivados
Author:
Centro/Departamento/Otros:
Subject:
Péptidos
Fenómenos de Membrana
Publication date:
Editorial:
Universidad de Oviedo
Descripción física:
Abstract:
Al gran valor biológico y nutricional que atesoran las proteínas presentes en el suero lácteo se ha unido en los últimos años un mayor conocimiento sobre su funcionalidad, tanto en su forma intacta como a través de los denominados péptidos bioactivos. Este último término hace referencia a segmentos proteicos específicos, inactivos dentro de la secuencia de la proteína nativa pero que pueden ser liberados por medio de hidrólisis enzimática o fermentación microbiana, y que tienen un impacto positivo en las funciones corporales, pudiendo en última instancia influir en la salud. El descubrimiento de estos péptidos bioactivos y su funcionalidad han llevado al desarrollo de nuevas y prometedoras aplicaciones en el campo médico y biotecnológico complementando así la utilización de las proteínas séricas en áreas más tradicionales. La comercialización de péptidos bioactivos específicos a partir de proteínas lácteas ha estado tradicionalmente limitada debido a la ausencia de tecnologías adecuadas que permitan su producción a escala industrial. En este sentido debe tenerse en cuenta que, una vez liberados tras la acción de una determinada enzima o microorganismo sobre la proteína de partida, la separación de los péptidos bioactivos del resto del hidrolizado proteico ha de llevarse a cabo mediante técnicas que permitan discriminar pequeñas diferencias en carga, peso molecular e hidrofobicidad. Hasta ahora, el fraccionamiento mediante membranas ha resultado ser una de las mejores tecnologías disponibles para el enriquecimiento de péptidos con un peso molecular específico. Además, la utilización de membranas cargadas ha permitido mejorar la selectividad de estos procesos ya que el importante papel que juegan las interacciones electrostáticas péptido-membrana hace que el mecanismo responsable de la separación resulte de una combinación de efectos de carga y tamaño. En el caso concreto de la ß-lactoglobulina (ß-lg), la proteína mayoritaria en el suero lácteo, su hidrólisis enzimática por la acción de la tripsina genera varias secuencias peptídicas cuya actividad funcional ha sido ampliamente estudiada y demostrada. Esto, junto con su aparente facilidad de purificación a partir de concentrados proteicos, hace de la ß-lg el sustrato ideal para la elaboración de productos enriquecidos en péptidos bioactivos, cuya consecución es el objetivo fundamental de esta tesis. En una primera fase se ha estudiado la obtención de un sustrato de elevada pureza en ß-lg a partir de concentrados de suero lácteo mediante un proceso de fraccionamiento basado en la precipitación reversible de la ¿-lactoalbúmina (¿-la) junto con el resto de las principales proteínas séricas. El sobrenadante obtenido tras la acidificación del concentrado sérico a pH 3.5 mediante la adición de un agente complejante de calcio y tratamiento térmico a 55ºC no presenta restos de ¿-la, seroalbúmina bovina (BSA) o inmunoglobulinas (Igs) y tan sólo contiene un 30% de la cantidad inicial de caseinomacropéptido (CMP). En segundo lugar se ha estudiado el proceso de hidrólisis de ß-lg con tripsina bajo las condiciones óptimas de actividad de la enzima (pH 8 y 37ºC). La identificación de los péptidos liberados en esta reacción mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF-MS y ESI-Q-TOF-MS/MS) y su seguimiento mediante RP-HPLC han llevado al desarrollo de un modelo cinético en el que la concentración de cada péptido se expresa como función del tiempo de hidrólisis. Una vez obtenido el hidrolizado proteico, se ha estudiado su fraccionamiento mediante la utilización de técnicas de membranas de ultra (UF) y nanofiltración (NF), prestando especial atención a la influencia de parámetros como el pH, la fuerza iónica, el tipo de membrana utilizada (material y corte molecular) o la concentración del hidrolizado en la selectividad del proceso. La aparición de importantes fuerzas electrostáticas de atracción/repulsión entre los péptidos y la membrana es en gran medida la responsable de la transmisión individual observada para cada péptido a bajas concentraciones de hidrolizado y baja fuerza iónica. Las mejores condiciones para la obtención de permeados enriquecidos en péptidos bioactivos se obtuvieron cuando el proceso de UF/NF se llevo a cabo con la membrana PES-5 a pH 8.0, baja fuerza iónica y una concentración inicial de proteína en el hidrolizado comprendida entre 10 y 15 g L-1. Finalmente, a través de la realización de distintos ensayos de actividad biológica se ha puesto de manifiesto que la etapa de fraccionamiento del hidrolizado mediante técnicas con membranas favorece la obtención de productos cuya biofuncionalidad se ve incrementada con respecto a los hidrolizados globales.
Al gran valor biológico y nutricional que atesoran las proteínas presentes en el suero lácteo se ha unido en los últimos años un mayor conocimiento sobre su funcionalidad, tanto en su forma intacta como a través de los denominados péptidos bioactivos. Este último término hace referencia a segmentos proteicos específicos, inactivos dentro de la secuencia de la proteína nativa pero que pueden ser liberados por medio de hidrólisis enzimática o fermentación microbiana, y que tienen un impacto positivo en las funciones corporales, pudiendo en última instancia influir en la salud. El descubrimiento de estos péptidos bioactivos y su funcionalidad han llevado al desarrollo de nuevas y prometedoras aplicaciones en el campo médico y biotecnológico complementando así la utilización de las proteínas séricas en áreas más tradicionales. La comercialización de péptidos bioactivos específicos a partir de proteínas lácteas ha estado tradicionalmente limitada debido a la ausencia de tecnologías adecuadas que permitan su producción a escala industrial. En este sentido debe tenerse en cuenta que, una vez liberados tras la acción de una determinada enzima o microorganismo sobre la proteína de partida, la separación de los péptidos bioactivos del resto del hidrolizado proteico ha de llevarse a cabo mediante técnicas que permitan discriminar pequeñas diferencias en carga, peso molecular e hidrofobicidad. Hasta ahora, el fraccionamiento mediante membranas ha resultado ser una de las mejores tecnologías disponibles para el enriquecimiento de péptidos con un peso molecular específico. Además, la utilización de membranas cargadas ha permitido mejorar la selectividad de estos procesos ya que el importante papel que juegan las interacciones electrostáticas péptido-membrana hace que el mecanismo responsable de la separación resulte de una combinación de efectos de carga y tamaño. En el caso concreto de la ß-lactoglobulina (ß-lg), la proteína mayoritaria en el suero lácteo, su hidrólisis enzimática por la acción de la tripsina genera varias secuencias peptídicas cuya actividad funcional ha sido ampliamente estudiada y demostrada. Esto, junto con su aparente facilidad de purificación a partir de concentrados proteicos, hace de la ß-lg el sustrato ideal para la elaboración de productos enriquecidos en péptidos bioactivos, cuya consecución es el objetivo fundamental de esta tesis. En una primera fase se ha estudiado la obtención de un sustrato de elevada pureza en ß-lg a partir de concentrados de suero lácteo mediante un proceso de fraccionamiento basado en la precipitación reversible de la ¿-lactoalbúmina (¿-la) junto con el resto de las principales proteínas séricas. El sobrenadante obtenido tras la acidificación del concentrado sérico a pH 3.5 mediante la adición de un agente complejante de calcio y tratamiento térmico a 55ºC no presenta restos de ¿-la, seroalbúmina bovina (BSA) o inmunoglobulinas (Igs) y tan sólo contiene un 30% de la cantidad inicial de caseinomacropéptido (CMP). En segundo lugar se ha estudiado el proceso de hidrólisis de ß-lg con tripsina bajo las condiciones óptimas de actividad de la enzima (pH 8 y 37ºC). La identificación de los péptidos liberados en esta reacción mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF-MS y ESI-Q-TOF-MS/MS) y su seguimiento mediante RP-HPLC han llevado al desarrollo de un modelo cinético en el que la concentración de cada péptido se expresa como función del tiempo de hidrólisis. Una vez obtenido el hidrolizado proteico, se ha estudiado su fraccionamiento mediante la utilización de técnicas de membranas de ultra (UF) y nanofiltración (NF), prestando especial atención a la influencia de parámetros como el pH, la fuerza iónica, el tipo de membrana utilizada (material y corte molecular) o la concentración del hidrolizado en la selectividad del proceso. La aparición de importantes fuerzas electrostáticas de atracción/repulsión entre los péptidos y la membrana es en gran medida la responsable de la transmisión individual observada para cada péptido a bajas concentraciones de hidrolizado y baja fuerza iónica. Las mejores condiciones para la obtención de permeados enriquecidos en péptidos bioactivos se obtuvieron cuando el proceso de UF/NF se llevo a cabo con la membrana PES-5 a pH 8.0, baja fuerza iónica y una concentración inicial de proteína en el hidrolizado comprendida entre 10 y 15 g L-1. Finalmente, a través de la realización de distintos ensayos de actividad biológica se ha puesto de manifiesto que la etapa de fraccionamiento del hidrolizado mediante técnicas con membranas favorece la obtención de productos cuya biofuncionalidad se ve incrementada con respecto a los hidrolizados globales.
Local Notes:
DT(SE) 2012-170
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