Papel de los exopolisacáridos del Bifidobacterium animalis subsp. lactis en el ecosistema intestinal

Abstract

El género Bifidobacterium es uno de los miembros que forman parte de la microbiota intestinal de diversos animales incluyendo el ser humano. Algunas especies de este género son capaces de sintetizar polímeros glicosídicos los cuales son excretados al exterior de la bacteria y pueden ser liberados completamente, o bien permanecer anclados a la membrana. Estos polímeros se denominan exopolisacáridos (EPS) y son los responsables de diversas características fisiológicas de la bacteria. Por un lado, al recubrirla ejercen un efecto protector frente a condiciones adversas, como pueden ser la presencia de ácido, sales biliares o toxinas sintetizadas por organismos patógenos. De esta manera, los EPS estarían directamente implicados en la supervivencia de la bacteria. Por otro lado, los EPS también influyen en la capacidad que presenta la bacteria productora para adherirse a la mucosa intestinal y su posterior colonización y persistencia. Además, la presencia en el intestino de bifidobacterias productoras de diferentes EPS puede generar distintas respuestas inmunes en el hospedador. Por último, al tratarse de polímeros glicosídicos, los EPS pueden ser metabolizados por otros miembros de la microbiota intestinal actuando como compuestos fermentables tipo “prebióticos”. Las bacterias lácticas productoras de distintos EPS son ampliamente utilizadas en la industria láctea, ya que permiten obtener productos fermentados con propiedades organolépticas mejoradas, tales como una mayor palatabilidad. Así mismo, en la industria se utilizan las bifidobacterias, en conjunción con otros géneros, para desarrollar probióticos que ayuden a restablecer la microbiota normal en casos de tratamientos de larga duración con antibióticos, entre otras aplicaciones. La especie Bifidobacterium animalis subsp. lactis es una de las más comúnmente utilizadas para el desarrollo de alimentos funcionales probióticos debido a su robustez. Es capaz de sobrevivir a los diferentes procesos tecnológicos de producción, ya que resisten las bajas temperaturas y a presencia de oxígeno a pesar de ser organismos anaerobios. En esta Tesis Doctoral hemos estudiado la producción de diferentes EPS por parte de B. animalis subsp. lactis y el posible papel biológico que estos polímeros pueden desempeñar a nivel intestinal. En el Capítulo 1 se presenta una revisión bibliográfica sobre los EPS producidos por cepas de Bifidobacterium y Lactobacillus, así como su interacción con el ecosistema intestinal. Se detallan los distintos tipos de polímeros según su composición en monómeros y su estructura, se expone la organización de los genes responsables de su síntesis, y se describen los receptores lectina tipo C presentes en el epitelio intestinal capaces de reconocer β-glucanos. Finalmente, se discuten las publicaciones más significativas y/o actuales en las que se estudia la implicación de los EPS sintetizados por diferentes cepas de Bifidobacterium y Lactobacillus en la modulación del sistema inmune y en la adhesión de estas cepas al epitelio intestinal, así como su participación en el desplazamiento de ciertos patógenos intestinales y su utilización como fuente de carbono por otros miembros de la microbiota intestinal. En el Capítulo 2 de esta Tesis Doctoral se aborda el desarrollo de un modelo de dos cepas isogénicas de B. animalis subsp. lactis productoras de diferentes EPS para estudiar sus características funcionales. En la colección de cepas de nuestro grupo de investigación se encuentra la cepa B. animalis subsp. lactis IPLA-R1 la cual adquirió un fenotipo “ropy” (filante) debido a una mutación espontánea en su genoma. Dicho fenotipo se debe a la producción de un EPS de elevado peso molecular y alto contenido en ramnosa. En estudios anteriores se identificó que esa mutación se encuentra en el gen Balat_1410 responsable de determinar la longitud de la cadena del polímero. El hecho de que esa mutación se generara de manera espontánea no nos asegura que no exista ninguna otra mutación en otra parte del genoma. Por ello, el objetivo de este capítulo fue el desarrollo de un modelo de cepas isogénicas a partir de la cepa tipo B. animalis subsp. lactis DSM10140. Mediante técnicas de doble recombinación homóloga, no utilizadas previamente en esta especie, se reemplazó el gen Balat_1410 por su forma mutada Balat_1410S89L. A continuación se comprobó que la estructura y composición del EPS “ropy” sintetizado por el nuevo mutante (S89L) coincidía con la del EPS producido por IPLA-R1. Posteriormente se abordó el marcaje fluorescente de las cepas DM10140 y S89L para su posible detección y/o seguimiento en nichos ecológicos complejos en estudios futuros. Para ello se sintetizaron dos plásmidos que expresan las proteínas fluorescentes GFP y mCherry bajo el control del promotor del factor de elongación Tu de B. animalis subsp. lactis. Se utilizó la técnica SOE-PCR para fusionar los genes del promotor y la proteína fluorescente y, a continuación, se clonó el fragmento fusionado en un plásmido replicativo. Una vez obtenidos los mutantes fluorescentes se comprobó la eficacia del marcaje mediante diversos métodos, tanto cualitativos como cuantitativos. Este marcaje nos permitió comparar la adhesión que presentan las cepas DSM10140-mCherry y S89L-mCherry a la línea celular intestinal humana HT29, así como su capacidad para formar biopelículas sobre superficies abióticas tales como vidrio, poliestireno y microelectrodos de oro. En todos los ensayos realizados los resultados obtenidos muestran que el mutante S89L con fenotipo “ropy” presenta menor capacidad de adhesión a la línea celular HT29 y menor capacidad de formación de biopelículas que la cepa parental “no-ropy” DSM10140. En el Capítulo 3 se estudió la posible interacción in vitro de las cepas isogénicas DSM10140 y S89L con diferentes receptores intestinales tipo Toll (TLR). Del mismo modo se estudió la interacción de sus EPS “ropy” y “no ropy”, previamente purificados, con los mismos receptores. Para ello, se utilizó un modelo comercial de líneas celulares embrionarias de riñón humano las cuales presentan en su superficie los receptores intestinales TLR2, TLR2/1, TLR2/6, TLR4 o TLR5. Además, estas líneas celulares poseen un sistema de cuantificación de señal mediante bioluminiscencia la cual es directamente proporcional a la cantidad de señal que generan los receptores. Se co-cultivaron diferentes concentraciones de suspensiones bacterianas con las distintas líneas celulares que expresan los TLR observándose que ambas cepas, DSM10140 y S89L, eran reconocidas por el receptor TLR2 generando un efecto dosis dependiente. Además, se observó que los niveles de señal generados eran iguales para ambas cepas. El hecho de que el ligando de TLR2 sean lipoproteínas, unido a que no hemos encontrado diferencias entre cepas, indica que la composición y/o estructura del EPS no están implicadas en el reconocimiento de estas cepas por TLR2; probablemente, este receptor está reconociendo otros componentes presentes en la pared bacteriana. Por otro lado, se co-cultivaron las líneas celulares que expresan los TLR con diferentes concentraciones de los EPS “ropy” y “no ropy” previamente purificados. En este caso, ambos polímeros fueron reconocidos por TLR4 generando una señal de la misma magnitud o incluso mayor que el control positivo; tampoco se detectaron diferencias entre cepas. Los receptores TLR4 reconocen lipopolisacárido (LPS) y cabía la posibilidad de que nuestras muestras de EPS purificados presentaran contaminación con LPS procedente del material de laboratorio. Para descartar esta posibilidad, se cuantificó la cantidad de LPS presente en nuestros EPS obteniéndose una cantidad ínfima. Además, se realizó un tratamiento de las muestras con polimixina B (la cual “secuestra” el LPS) y posteriormente se repitieron los ensayos con la línea celular portadora del TLR4. De nuevo, los resultados mostraron que los EPS tratados con polimixina B eran capaces de generar una señal del mismo nivel, o mayor, que el control positivo, confirmando la hipótesis de que la respuesta no se debía a contaminación por LPS, sino que los receptores TLR4 son capaces de reconocer los dos EPS bacterianos estudiados. Para completar esta Tesis Doctoral, en el capítulo 4 se analizó el efecto que podría ejercer la administración oral de nuestras cepas de B. animalis subsp. lactis en un modelo murino in vivo. Para ello, se utilizaron 114 ratones los cuales se dividieron en tres grupos: grupo DSM10140, grupo S89L y grupo control de referencia (sin tratamiento). Durante 10 días, a los ratones de los grupos de tratamiento se les administró mediante sonda gástrica diariamente una suspensión bacteriana (≈ 9 unidades logarítmicas / ml) preparada en 100 μl de leche tindalizada. Una vez finalizado el periodo de intervención se realizaron diversos puntos de muestreo durante 7 días, recolectando el contenido colónico tras el sacrificio del animal. A partir de dichas muestras se realizó una extracción de ADN y secuenciación de un fragmento de la subunidad 16S del ARN ribosomal mediante la tecnología MiSeq (Illumina), llevándose a cabo un análisis bioinformático de las lecturas y clasificación taxonómica. A nivel de filo, no se observaron diferencias significativas en las abundancias relativas de los grupos de tratamiento respecto al grupo control durante el periodo de intervención. Sin embargo, sí se apreciaron cambios en las abundancias relativas durante el periodo post-intervención en ambos grupos de tratamiento. En los días 1 y 3 se observó un aumento en los filos Actinobacteria y Bacteroidetes, mientras descendió la abundancia de los miembros del filo Firmicutes¸ aunque este efecto revirtió a lo largo del periodo post-intervención. En el caso del filo Proteobacteria se observó una reducción de su abundancia en ambos grupos de tratamiento en los primeros puntos de muestreo tras la intervención, en comparación con el grupo control; sin embargo, este efecto sólo se mantuvo en el tiempo en el grupo de tratamiento S89L. A nivel de familia, el cambio más significativo se produjo en el grupo de tratamiento S89L al final del periodo de intervención, donde se observó un aumento de las abundancias relativas de Lactobacillaceae y un descenso de Bacteroidaceae y Ruminococcaceae (clase Clostridia) y Rikenellaceae. Por otro lado, en el periodo post-intervención también se observaron cambios en las abundancias relativas en ambos grupos de tratamiento respecto al grupo control; uno de estos cambios fue un aumento de la familia Bacteroidaceae S24-7 al inicio de este periodo. Finalmente, también se observaron diferencias entre los dos grupos de tratamiento, donde las familias Desulfovibrionaceae y Coriobacteriaceae se vieron reducidas en el grupo S89L respecto al grupo tratado con la cepa parental (no-ropy) DSM10140. En general, la abundancia relativa de los taxa que han sido relacionados con estados pro-inflamatorios fue menor en el grupo de ratones tratados con la cepa ropy S89L que produce un polímero de elevado peso molecular y rico en ramnosa. Por tanto, la presencia de EPS de distinto tamaño en la superficie de B. animalis susbp. lactis moduló de forma diferencial la microbiota intestinal. En esta Tesis Doctoral hemos demostrado que los EPS sintetizados por B. animalis subsp. lactis son capaces de interaccionar específicamente con receptores TLR4 localizados en el epitelio intestinal, y de modular de forma diferencial, dependiendo del tipo de polímero producido, la microbiota intestinal. Por tanto, estos polímeros pueden estar implicados en las propiedades beneficiosas de cepas de esta especie ampliamente utilizada en la formulación de alimentos funcionales o suplementos alimentarios probióticos.