Nuevas metodologías basadas en espectrometría de masas para la determinación de (metalo-) enzimas como posibles biomarcadores de enfermedades oculares, diabetes y cáncer de mama

Abstract

Una de las paradojas de la naturaleza es que el oxígeno, imprescindible para mantener la vida de los organismos aerobios, es también el punto de partida para la producción, durante el metabolismo celular, de especies oxidantes muy reactivas (especies reactivas de oxígeno, ROS) que pueden dañar a las biomoléculas esenciales para el desarrollo y crecimiento de las células. Por ello, los organismos aerobios han tenido que desarrollar una serie de estrategias adaptativas para paliar la producción indeseada de dichas especies oxidantes y minimizar sus efectos. De este modo, se mantiene un balance de óxido-reducción constante (homeostasis redox) y los sistemas de defensa antioxidantes. La pérdida de este balance óxido-reducción, a favor de las ROS, lleva a una situación conocida como estrés oxidativo cuya relación con los mecanismos fisiopatológicos para la iniciación y desarrollo de enfermedades de notable morbilidad y mortalidad constituye un área de investigación de enorme interés y actualidad. Algunas de las patologías más relevantes relacionadas con el estrés oxidativo son las enfermedades cardiovasculares, patologías digestivas, enfermedades neurodegenerativas, diabetes, cáncer, artritis y envejecimiento. En este contexto, el objetivo de la Tesis doctoral es la búsqueda de posibles biomarcadores de enfermedades oculares, diabetes y cáncer de mama, a través del desarrollo de nuevas metodologías basadas en espectrometría de masas. El objetivo general anteriormente propuesto se ha llevado a cabo a través de varios objetivos parciales. Hoy en dia, se ha aceptado que el estrés oxidativo está implicado en diversas patologíás. El organismo contiene una serie de antioxidantes que juegan un papel clave en su protección contra el daño oxidativo de ROS. En particular, el selenio es considerado uno de tales agentes protectores de ROS, luego la identificación y cuantificación de especies de selenio (especiación) constituye una nueva herramienta para investigar el papel de las selenoproteínas en estas enfermedades, relacionadas con el estrés oxidativo particularmente en relación con las actividades redox de las enzimas GPx. Por lo que en el primer Capítulo de la Tesis doctoral, se ha desarrollado una metodología para la especiación cuantitativa de selenio en muestras de humor vítreo humano basada en HPLC-ICP-MS y su posterior cuantificación mediante el análisis por dilución isotópica (IDA) post columna. Del mismo modo se investigó la relación entre los niveles de GPx, sus oligómeros y la actividad enzimática en estas muestras y la posible conexión de tales parámetros con enfermedades oculares. En el segundo capítulo, se llevó a cabo la especiación cuantitativa de selenoproteínas en muestras de pacientes con patologías oculares ydiabéticos y sanos mediante cromatografía de afinidad, AF-HPLC-ICP-MS. Paralelamente se evaluó la actividad enzimática de la GPx en dichos pacientes. Y se discutieron las posibilidades de medir la actividad de la GPx directamente a través de la oligomerización de la proteína y su relación con la posible glicosilacion de la misma. En el objetivo anterior se demostró que, una prolongada exposición a elevados niveles de glucosa puede causar la oxidación de las proteínas. Por lo que en el tercer capítulo se llevó a cabo un estudio in vitro de la suplementacion, de una línea celular de RPE, con diferentes concentraciones de glucosa así como una mezcla de selenito y glucosa, con el fin de determinar el efecto de la glucosa en la oxidación de proteínas y el papel protector/antioxidante del selenito. En el último Capítulo, se llevo a cabo la aplicación de las técnicas de LA-MS al estudio de distribución de elementos traza esenciales y MMP11 como posibles biomarcadores de cáncer de mama. Los métodos presentados permitieron una investigación detallada del metabolismo alterado de los metales y proteínas en el cáncer de mama que eventualmente podría correlacionarse con otras características histológicas y, por lo tanto, serán una herramienta útil en la práctica clínica y la investigación.