Biodiversidad microbiana en drenaje ácido de minas y sueldos contaminados con metales y sus aplicaciones biotecnológicas

Abstract

Asturias (Noroeste de España), se caracteriza por la existencia de un número significativo de áreas degradadas de la antigua minería (carbón y metales), resultantes del desmantelamiento de la industria (química, metalúrgica y siderúrgica) con una contaminación significativa. Estas actividades antropogénicas han generado residuos con alto contenido de metales y metaloides en la superficie, siendo el arsénico uno de los elementos más peligrosos. Dos ejemplos representativos de sistemas afectados por estas actividades y la subsiguiente contaminación por arsénico, son el drenaje ácido de minas (AMD) y los suelos industriales contaminados. Los Rueldos, una mina de mercurio abandonada en Mieres, Asturias, ha originado un ambiente AMD típico, donde un conjunto muy específico de condiciones geoquímicas determinó e impulsó el desarrollo de una comunidad microbiana única. El otro ambiente estudiado ha sido la rizósfera de abedul (Betula celtiberica) creciendo en el emplazamiento contaminado de Nitrastur, una industria de fertilizantes abandonada ubicada en Langreo, Asturias. Estos hábitats constituyen modelos ideales para comprender los mecanismos que permiten a los microorganismos desarrollarse y evolucionar en condiciones adversas y por lo tanto generar estos ecosistemas especiales; un motivo adicional de estudio es que albergan una serie de capacidades metabólicas con potencial interés biotecnológico, como hemos corroborado posteriormente mediante experimentos de cribado enzimático y fitorremediación en ambos emplazamientos. Para establecer la base de nuestro estudio, hemos investigado inicialmente la diversidad y función microbiana en los dominios Bacteria, Archaea y Eukarya, en los microhábitats de sedimentos, agua ácida y biopelículas (“streamers”) que coexisten en el ambiente ácido de la mina de Los Rueldos, así como el microbioma bacteriano de las plantas que crecen en los suelos contaminados de Nitrastur, mediante la pirosecuenciación de la subunidad 16S / 18S de ARNr, análisis de la librería de clones del gen rRNA 18S y reconstrucción metagenómica a partir de las secuencias de los genes 16S rRNA. En el sedimento de Los Rueldos predominan bacterias del suelo (filo “candidate” AD3, filo Acidobacteria) y arqueas (filo Crenarchaeota y filo Euryarchaeota, familia Methanomassiliicoccaceae). La biopelícula subaérea localizada en la interface roca / agua ácida y en la interface sedimento / agua, están enriquecidas en bacterias oxidantes de hierro (como es el género Leptospirillum), bacterias de clase Betaproteobacteria y orden Acidithiobacillales, y arqueas del filo Euryarchaeota, clase Thermoplasmata. Las muestras de agua estaban enriquecidas en representantes del filo Cyanobacteria y arqueas de la clase Thermoplasmata en las zonas influenciadas (3-98%) por la luz solar, mientras que representantes de la clase Betaproteobacteria, del filo Candidatus Micrarchaeota (genero Candidatus Micrarchaeum acidiphilum, ARMAN-2) y de la clase Thermoplasmata del filo Euryarchaeota dominan en el agua ácida sometida a oscuridad total. Las estalactitas que cuelgan del techo de la galería, ricas en hierro, estaban colonizadas por oxidantes de hierro neutrofílicos del género Gallionella (phylum Proteobacteria) y representantes de los filos Chlorobi y Chloroflexi, todos ellos ausentes en el resto de los microhábitats ácidos estudiados. Diferentes microorganismos eucariotas se detectaron en las biopelículas y muestras de agua al aire libre, pertenecientes principalmente a los clados SAR (Alveolata y Stramenopiles), y Opisthokonta (reino Fungi). Las biopelículas ácidas oxigenadas y las anóxicas mostraron las proporciones más altas de ciliados Alveolata (géneros Gonostomum, Oxytricha), mientras que las muestras de agua externas estaban enriquecidas con hongos (género Paramicrosporidium y formas microbianas de Helotiales). La información obtenida a partir de la composición de la comunidad bacteriana sugiere una convergencia evolutiva adaptativa de la función en estas comunidades heterogéneas. Además de los datos disponibles a partir del análisis de la diversidad, obtuvimos más información directa sobre el metabolismo de las bacterias, arqueas y especialmente de las Euryarchaeota relacionadas con “ARMAN” (Archaeal Richmond Mine Acidophilic Nanoorganisms) encontradas en el drenaje ácido de Los Rueldos, mediante la realización de un estudio metabolómico en los estratos oxigenados superiores (B1A) y subóxicos inferiores (B1B) de las biopelículas microbianas. Como resultado de este enfoque, se detectaron 3101 características de masa asociadas a la actividad metabólica de los organismos, lo que nos permitió comprobar que la fracción 'ARMAN' se comportaba metabólicamente diferente en comparación con bacterias / arqueas. Algunos de los cambios significativos observados fueron una capacidad disminuida para producir algunos aminoácidos y la ausencia de lípidos de la membrana celular en esos nano-organismos. Con el fin de explorar las posibles aplicaciones biotecnológicas de los microorganismos de Los Rueldos, se aplicaron búsquedas de homología en las secuencias metagenómicas y actividad enzimática a partir de librerías de clones (genoteca) sobre diversos sustratos, para detectar enzimas útiles desde el punto de vista industrial, en las biopelículas microbianas. Se recuperaron de esta forma 16 presumibles esterasas y lipasas de la superfamilia de plegamiento α/β-hidrolasa. Las enzimas provenían de bacterias no cultivadas del filo Actinobacteria (géneros relacionados con Acidithrix, Acidifilium y Acidimicrobium / Ferrimicrobium), filo Acidobacteria y filo Proteobacteria (especies desconocidas y un género relacionado con Acidiphilium). La mayoría de las enzimas estaban débilmente relacionadas con proteínas homólogas ya descritas, incluyendo las de otros sitios de AMD. La actividad hidrolítica se confirmó en 9 de las 16 hidrolasas usando un conjunto de 96 ésteres diferentes estructuralmente. Se detectaron características notables asociadas a esas esterasas bacterianas (alta y amplia actividad sobre los sustratos, estabilidad frente a los ácidos, enantio-selectividad y otras propiedades interesantes) que abren nuevas perspectivas potencialmente útiles para su uso en biocatálisis. Los estudios en Nitrastur incluyeron el análisis completo del rizobioma de las plantas de Betula celtiberica que crecían en los suelos contaminados. Los taxones predominantes pertenecían al filo Proteobacteria (orden Burkholderiales y Pseudomonadales) y filo Bacteroidetes (orden Flavobacteriales), especialmente los géneros Pseudomonas y Flavobacterium. Se aislaron un total de 54 rizobacterias cultivables y 41 endofitas de raíz, principalmente afiliadas a los filos Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Actinobacteria, que fueron caracterizadas con respecto a varias propiedades potencialmente útiles para la acumulación de metales por la planta, como la capacidad de promover su crecimiento, la capacidad de secuestrar (quelar) arsénico y/o de mitigar el estrés promovido por metales pesados. Se seleccionaron siete bacterias y se analizó su efecto in vitro en la acumulación de arsénico por las plantas; cuatro de ellas se probaron finalmente en experimentos de bioaumentación/fitorremediación a escala de campo. La exposición al arsénico in vitro provocó un aumento del contenido total de compuestos tiólicos no proteicos en las raíces, lo que sugiere un mecanismo de detoxificación a través de la complejación con fitoquelatinas. En los estudios en campo, el consorcio formado por las bacterias endofíticas Variovorax paradoxus y Phyllobacterium myrsinacearum, productoras de sideróforos y ácido indol-3-acético, potenciaron la acumulación de arsenico en las hojas y raíces de Betula celtiberica, mientras que la bacteria rizosférica Ensifer adhaerens cepa 91R promovió principalmente el crecimiento de las plantas. Un segundo experimento de inoculación de Betula celtiberica a escala de campo con algunas de las bacterias utilizadas en Nitrastur, se realizó en El Terronal (Mieres, Asturias), un emplazamiento con actividad minera y metalurgica de Hg-As, con presencia en los suelos de pirita rica en arsénico. Los resultados mostraron un efecto positivo del consorcio endofítico sobre la acumulación de arsénico en las raíces, comparable en ambos estudios de campo. También se observó un aumento en la biomasa de hojas/raíces de las plantas de El Terronal inoculadas con Ensifer adhaerens, similar al obtenido en Nitrastur. Adicionalmente, los resultados en campo demostraron que otros factores, como el contenido de arsénico del suelo y el pH, influyen en la absorción de arsénico por la planta, lo que indica que las condiciones de campo influyen también en el éxito de las estrategias de fitoextracción y son un factor adicional que se debe considerar.