Miocardiopatía hipertrófica: Identificación de nuevos genes mediante técnicas de secuenciación masiva

Abstract

La Miocardiopatía Hipertrtófica (MCH) es la enfermedad cardiaca hereditaria más común, con una indicencia de 1/500. Está causada mayoritariamente por variantes patológicas de la secuencia del ADN en los genes que codifican proteínas del sarcómero, la unidad funcional contráctil del músculo, entre las que destacan los genes de la cadena pesada de la beta miosina (MYH7) y de la proteína C de unión a la beta miosina (MYBPC3). Entre las dos son responsables de aproximadamente el 50% de los casos de MCH en los que se han hallado mutaciones causales. Sin embargo, en un 30-60% de los casos la variante genética causal no es identificada, por lo que deben existir otros genes relacionados con la patología, aún no descritos. La secuenciación masiva o de nueva generación, next generation sequencing (NGS) en sus siglas en Inglés, ha revolucionado el campo de la Genética. Dichas técnicas presentan tres ventajas fundamentales respecto al método de secuenciación tradicional, o método de Sanger: la creación de las librerías se lleva a cabo sin la necesidad de clonación bacteriana (es decir, es un sistema libre de células), la realización de múltiples de reacciones de secuenciación en paralelo, y sin necesidad de llevar a cabo una electroforesis para visualizar las secuencias. Estas tres características han supuesto una drástica disminución en los costes y el tiempo de estudio, a la vez que se producía un aumento exponencial del número de lecturas de pares de bases secuenciadas por experimento. Dentro de las numerosas aplicaciones de la NGS, la secuenciación de todas la región codificante del ADN o exoma, ha supuesto una avance muy significativo a la hora de identificar nuevos genes asociados a diversas patologías. Con estos antecedentes, nos propusimos los objetivos de desarrollar un protocolo de secuenciación masiva mediante chips semiconductores (NGS Ion Torrent Personal Genome Machine, PGM) para el cribado de los principales genes asociados a la MCH, de tal manera que pudiéramos aumentar la cantidad de genes estudiados a la vez que disminuíamos los costes y el tiempo necesario para ello. El protocolo sería extensible a cualquier laboratorio para facilitar el diagnóstico genético de la enfermedad. A partir de las familias sin mutación sarcomérica identificada, nos propusimos como segundo objetivo la búsqueda de nuevos genes candidatos mediante análisis del exoma y posterior validación con estudios funcionales. 1. Diseñamos un panel (software Ion Ampliseq Designer) que contuviera la secuencia codificante y al menos las 5 pares de bases intrónicas flanqueantes de los principales genes asociados a la MCH: MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, TPM1, MYL2, MYL3, ACTC1, y TNNC1. Para la validación de dicho protocolo, secuenciamos muestras “control” que ya sabíamos que eran portadores de alguna variante patogénica. Identificamos todas estas variantes, por lo que concluimos que nuestro protocolo de secuenciación masiva era válido para el cribado de los principales genes asociados a la MCH, y como tal definimos el espectro mutaciones de los 9 genes en una cohorte de más de 500 pacientes. 2. A continuación seleccionamos una serie de pacientes sin mutación en los principales genes asociados a la MCH, y secuenciamos su exoma. Tras el análisis bioinformático identificamos al gen de la filamina C (FLNC) como el mejor candidato, por lo que analizamos su secuencia en una cohorte de 448 pacientes y 450 controles. Entre los pacientes había 168 portadores de una posible mutación en los principales genes sarcoméricos. Identificamos un total de 38 variantes con posible efecto funcional (incluyendo una variante sin sentido) en el gen FLNC en la cohorte de MCHs, frente a sólo 22 variantes entre los controles. De todas estas, 25 estaban presentes solo en los pacientes frente a solo 9 en solo los controles (p<0.05). A su vez, 13 de las variantes identificadas en los pacientes no estaban descritas en las bases de datos del exoma, por solo una de las halladas en los controles (p<0.05). De las 38 variantes de la cohorte de MCHs seleccionamos 20 en 22 portadores para realizar estudios de co-segregación familiar. De ellas, 4 pacientes eran a su vez portadores de variantes en los genes MYH7 ó MYBPC3, por 18 que eran portadores sólo de variantes en FLNC, resultando en diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos. Pudimos realizar dichos estudios en 15 variantes, pertenecientes a 16 familias. Entre los pacientes de MCH sin variación causal identificada en los principales genes sarcoméricos, en 11 familias de las estudiadas había al menos un segundo familiar con signos de MCH y todos ellos eran portadores de la correspondiente variante en FLNC. En total, en estas familias identificamos un total de 36 portadores de variantes en FLNC, mostrando 27 de ellos signos de MCH. 3. Además, realizamos estudios funcionales en tejido cardiaco de dos de las variantes en FLNC, observando la formación de agregados de filamina c. Mediante mutagénesis dirigida se transfectaron en células cardiacas de rata los ADNc de 4 de las variantes, y se comprobó que resultaban en la formación de agregados de flnc. Por tanto, basándonos en la frecuencia poblacional de variantes candidatas (enfermos y controles), los predictores bioinformáticos, la segregación familiar, y los estudios funcionales clasificamos a las variantes en FLNC como probablemente patogénicas (n=6), posiblemente patogénicas (n=3), de significado incierto (n=7), y probablemente benignas (n=4). En resumen, el protocolo de secuenciación masiva mediante chips semiconductores es un método válido para el cribado de los principales genes asociados a la Miocardiopatía hipertrófica, con una reducción importante de coste y tiempo de trabajo. Es trasladable a la práctica clínica (cribado genético) con resultados similares a los descritos para otras técnicas de NGS. Por otro lado, presentamos evidencias de que el gen FLNC estaría implicado en el desarrollo de un número significativo de casos de MCH, que podría llegar al 2% del total en nuestra población. Sin embargo, la penetrancia incompleta y el carácter benigno de la mayoría de las variantes identificadas resulta a menudo en una clasificación como de significado patogénico incierto, lo que puede dificultar su empleo como predictoras del riesgo de desarrollar la enfermedad entre los portadores y, por tanto, limitar el consejo genético familiar