Nuevas estrategias analíticas para el estudio de posibles biomarcadores de resistencia a cisplatino en modelos celulares

Abstract

El cisplatino se emplea para el tratamiento de una gran variedad de tumores sólidos entre los que se incluyen el cáncer de ovario, de vejiga y el cáncer de pulmón, siendo especialmente eficaz para el tratamiento del cáncer de testículo. Lamentablemente, casi el 50% de los pacientes con cáncer presentan tumores que son resistentes al fármaco y muchos de ellos han desarrollado resistencia durante el curso del tratamiento a pesar de haber presentado una respuesta inicial positiva al mismo. En este sentido, se estima que la resistencia a la quimioterapia contribuye a más del 90% de las muertes por cáncer. Las causas de esta resistencia, tanto intrínseca como adquirida, aún están lejos de ser conocidas, pero sí se sabe que son complejas y multifactoriales. De manera que un mayor conocimiento acerca de dicha resistencia ayudaría a identificar los marcadores que podrían facilitar la predicción de la respuesta clínica al tratamiento. Lo que haría posible ajustar la terapia según la necesidad del paciente. En este sentido, la búsqueda de potenciales biomarcadores que predigan dicha resistencia de forma sensible y su determinación en muestras biológicas constituye un gran desafío para la química analítica. Por todo ello, el objetivo general de la presente Tesis Doctoral ha consistido en el desarrollo de nuevas estrategias para estudiar posibles biomarcadores de resistencia del cisplatino y su aplicación en el estudio de modelos celulares de cáncer de ovario. Los estudios realizados se han centrado en la evaluación de la metilación celular, desarrollando estrategias para su determinación: i) a través del grado de metilación del DNA; ii) del índice de metilación celular (SAM/SAH) y iii) de la actividad de las enzimas que catalizan dicho proceso. Así mismo, se han evaluado cambios en el número de copias de uno o varios genes implicados en la resistencia al cisplatino con un sistema alternativo a la PCR cuantitativa. Los resultados más importantes de estos estudios se resumen a continuación: o Se han desarrollado metodologías de HPLC-VIS/UV y HPLC-ICP-MS para la separación y detección de los nucleótidos del ADN que permiten la cuantificación del nivel de metilación global del ADN, así como en regiones promotoras de genes relacionados con la resistencia a cisplatino. El sistema HPLC-UV se empleó para la determinación del nivel de metilación global de ADN extraído de diferentes líneas celulares de cáncer de ovario sensibles y resistentes a cisplatino (A2780 y A2780cis) antes y después de un tratamiento con dicho fármaco encontrando diferencias importantes en algunos casos. Del mismo modo, en colaboración con la Dra. L.M. Sierra del Departamento de Genética se analizó el nivel de metilación en las regiones promotoras de los genes: ERCC1, POLQ y ERCC4 (implicados en procesos de apoptosis) y TP53, BAX, BCL-2 y CASP3 (implicados en la reparación de los daños inducidos en el ADN por el cisplatino) en dichas líneas sensibles y resistentes a cisplatino (A2780 y A2780CIS) donde se observaron cambios específicamente en el gen ERCC1. o Se han puesto a punto estrategias basadas en HPLC-UV, HPLC-ICP-MS y LC-MS/MS y comparadas analíticamente para la separación y cuantificación de los compuestos S-adenosilmetionina (SAM) y S-adenosilhomocisteína (SAH). La metodología basada en LC-MS/MS que proporcionó mejores características analíticas se aplicó en la determinación de la relación SAM/SAH en cultivos celulares sensibles y resistentes a cisplatino (A2780 y A2780cis) y fue posible establecer una correlación entre el índice de metilación (SAM/SAH) y el grado de metilación del ADN en las mismas muestras. o Puesto que la transferencia de grupos metilo a distintas biomoléculas, en particular al DNA, ocurre a través la reacción catalizada por varias DNA metil transferasas, se ha desarrollo una estrategia analítica que permite el estudio de la actividad de dichas enzima en cultivos celulares de cáncer de ovario mediante la medida indirecta de la formación de 5-metilcitosina (5-mC) empleando la técnica basada en HPLC-UV previamente desarrollada. o Finalmente, como último marcador de resistencia se ha evaluado la variación en el número de copias de genes específicos (CNVs) desarrollando una metodología analítica para la cuantificación alternativa a la PCR cuantitativa basada en la combinación de la reacción en cadena de la polimerasa con la electroforesis en gel de agarosa en columna de vidrio y conectada en línea con el plasma de acoplamiento inductivo espectrometría de masas (GE-ICP-MS) para la detección específica del 31P. Empleando dicha estrategia se ha evaluado el efecto del tratamiento con cisplatino sobre la variación del número de copias de un gen modelo (POLQ) en la línea celular GM04312 deficiente en el sistema NER. Finalmente se ha optimizado la metodología desarrollada para permitir la amplificación, separación y cuantificación múltiple (multiplex PCR-MS) de cuatro genes distintos relacionados con la respuesta celular a cisplatino.