Caracterización funcional de la microbiota intestinal en algunos trastornos inmunológicos

Abstract

La microbiota intestinal es el conjunto de microorganismos que habita en inmunológicoel intestino humano de manera natural, estableciendo una relación estrecha con el hospedador que la alberga, al que le proporciona una serie de beneficios entre los que cabe destacar la función barrera contra bacterias potencialmente patógenas, el aprovechamiento de energía de alimentos no digeribles, y la maduración y desarrollo del sistema inmunológico. Hasta el momento, tanto estudios en humanos como en animales han demostrado que cambios en las poblaciones microbianas intestinales pueden tener consecuencias para la salud, y existen numerosos trabajos científicos que relacionan a una microbiota intestinal alterada (disbiosis intestinal), con procesos inflamatorios, asma alérgicos, enfermedades autoinmunes e incluso cáncer. El objetivo general de esta Tesis Doctoral es generar nuevo conocimiento sobre la composición de la microbiota intestinal en el marco de dos trastornos inmunológicos, el lupus eritematoso sistémico (LES) y el asma. A través del uso de técnicas independientes de cultivo, se analizaron muestras fecales y se determinó el perfil microbiano de grupos de individuos que padecían estas enfermedades, comparándolo con el de individuos sanos. De esta manera los resultados de esta Tesis Doctoral han contribuido a entender la relación entre la disbiosis intestinal que presenta la microbiota de estos individuos y su estado inmunológico. Para el caso del LES se estudiaron 20 mujeres de entre 34 y 68 años de edad, y se compararon con un grupo control sano. En asma alérgico se analizaron muestras de 21 pacientes de edades entre 24 y 57 años y se compararon con un grupo de 22 controles sanos de mismo sexo y rango de edad. Durante la primera parte de esta Tesis se optimizaron metodologías y protocolos de tratamiento de muestras fecales humanas. Posteriormente se extrajo el ADN de muestras fecales de los distintos individuos para establecer los perfiles de composición microbianos de cada grupo (LES y asma) mediante la amplificación y análisis de la secuencia del gen del ARN ribosomal 16S bacteriano. En el grupo de LES se obtuvieron niveles diferentes de los dos grupos bacterianos mayoritarios que colonizan el intestino, Bacteroidetes y Firmicutes, con un ratio Firmicutes/Bacteroidetes mucho menor que para los controles sanos. Por otro lado se realizó la cuantificación de metabolitos producidos por la microbiota intestinal de individuos con LES, en comparación con el grupo control, mediante metabolómica, observándose un pequeño grupo de compuestos relacionados con estrés oxidativo producidos por la microbiota de LES. También se observaron diferencias entre individuos sanos de alto y bajo índice de masa corporal, factor que no fue determinante en el caso del LES. Por otro lado, en el grupo de asmáticos no hallamos diferencias significativas en la biodiversidad microbiana en comparación con un grupo de controles sanos, ni tampoco en las abundancias relativas de ningún grupo taxonómico salvo para la especie Bifidobacterium adolescentis, para la que se observaron niveles menores en pacientes con respecto a la duración del proceso asmático. Por último, y mediante experimentos in vitro, se observó que la microbiota aislada de pacientes con LES induce una respuesta Th17, y que la suplementación de esta microbiota con Bifidobacterium bifidum o con una mezcla de las especies comensales Ruminococcus obeum y Blautia coccoides, corrigió en cierta medida el desequilibrio inmunológico, bien reduciendo la diferenciación de células T vírgenes hacia Thelper en el caso de la bifidobacteria, o bien a través de una reducción dosis-dependiente del ratio IL-17/IFNɣ en el caso de la mezcla de Firmicutes, lo cual se interpretó como una reducción de la diferenciación de células T vírgenes a células Th1. SUMMARY Gut microbiota is the global community of microorganisms that naturally inhabit the human gastrointestinal tract, establishing tight interactions with their host and exerting a great number of benefits. For instance, it contributes to the gut barrier function inhibiting the colonization by potential bacterial pathogens, to energy harvesting from non-digestible foods, and to the development and maturation of the immune system. Several human and animal model studies have shown some changes in the gut bacterial populations that can have important consequences in health, and there is a broad range of scientific works relating an imbalanced intestinal microbiota, also known as dysbiosis, with inflammatory processes, allergy, autoimmune diseases or even cancer. The main aim of this Doctoral Thesis was the generation of novel knowledge about the gut microbiota composition in the frame of two immune disorders, systemic lupus erythematosus (SLE), and allergic asthma. By means of culture-independent techniques, fecal samples from the individuals of both groups were analyzed and compared with healthy controls. In this way we have contributed with this Thesis to understand the relationship between gut dysbiosis and the immunological state of the host. In the SLE group we analyzed a group of 20 women aged of 34-68 years, and their gut microbiotas were compared with a control group of 20 healthy women. For the allergic asthma group, the intestinal microbiota of 21 patients, men and women, whose age was comprised between 24 and 57 years old was analyzed and compared with a control group of 22 healthy individuals of the same sex and age ranges. First of all we optimized the methodologies and protocols to analyze the fecal microbiota in SLE and allergy. We set up a protocol to separate the fecal microbiota from its complex matrix without altering its microbial composition significantly, and we also extracted the DNA from the samples to establish the bacterial profiles of each population group, using a 16S rARN gene-based profiling. In the SLE group we obtained different bacterial abundances within the Phyla Bacteroidetes (B) and Firmicutes (F), and a decreased F/B ratio compared to healthy controls. We also quantified metabolites produced by the microbiota of SLE and we observed higher levels of a small group of metabolites that were related to oxidative stress; we also identified some differences in metabolites produced by healthy controls with high and low body mass index. In the allergic asthma group we found no significant differences in the biodiversity of the gut microbiota compared with controls. However, we observed decreased abundancies of Bifidobacterium adolescentis in individuals with long-term asthma. We also found, in co-culture in vitro experiments, that the isolated microbiota of SLE induces a Th17 immune response, and that the supplementation with Bifidobacterium bifidum and with a mix of the commensal bacteria Ruminococcus obeum y Blautia coccoides can revert the immunological state of SLE, by reducing T cell differentiation to Thelper, or inducing a dose-dependent decrease in the IL-17/IFNɣ proinflammatory ratio.