Vectores de expresión de cDNAs genómicos de Rabbit vesivirus (RaV) y análisis de su funcionalidad como clones infectivos

Abstract

El establecimiento de un sistema de genética reversa para Rabbit vesivirus (RaV) ha sido uno de los objetivos principales de nuestro grupo en los últimos años. En el contexto de la Virología Molecular, el término genética reversa se refiere a una metodología en la que se introducen cambios en determinadas regiones del genoma viral y se estudia el efecto de estos cambios sobre la generación de una progenie infectiva y sus características. Debido a las dificultades técnicas que presenta modificar el RNA, estos cambios se realizan sobre un vector plasmídico que contiene una copia del genoma en forma de cDNA, obtenida mediante transcripción inversa. Por esta razón, el rescate de viriones infectivos a partir de este vector es un requisito previo para cualquier estudio de genética reversa. En el presente trabajo se implementaron varias estrategias con el fin de construir un sistema de este tipo para RaV. Las estrategias se enfocaron hacia la generación de transcritos de RNA que imitaran lo más fielmente posible a lo que se cree que es la secuencia del genoma viral, evitando la incorporación de nucleótidos no virales en los extremos 5’ y 3’. Se diseñaron y generaron vectores de expresión del genoma de RaV bajo el control de los promotores de las RNA-polimerasas de los fagos SP6 y T7. Estos vectores se usaron en ensayos de transcripción in vitro y el RNA de longitud genómica así obtenido se empleó para intentar el rescate de virus mediante transfección de líneas celulares de mamíferos de distintos orígenes (Hek 293T, Vero, BSR-T75) y en experimentos de traducción in vitro o de transcripción-traducción acopladas. Los vectores de expresión del genoma controlados por el promotor de T7 se usaron adicionalmente para intentar el rescate de virus mediante su transfección directa en células de mamífero, evitando el paso previo de transcripción in vitro. Para ello fue necesario suministrar en trans la enzima T7 RNA-polimerasa, mediante infección con FPV-T7 (un poxvirus recombinante que la produce), mediante el empleo de una línea celular transformante estable que expresa el gen que codifica esta enzima, o mediante una combinación de ambas técnicas. Se generó un vector que contiene el IRES de EMCV precediendo al genoma para investigar su acción potenciadora de la traducción y el efecto de ésta sobre el rescate de virus. Por otra parte se construyeron vectores de expresión del genoma controlados por el promotor fuerte de CMV, que se usaron en experimentos de rescate sobre las mismas líneas celulares. Las transfecciones con RNA sintético no permitieron el rescate de virus infectivo y se demostró que la traducción de estos transcritos es ineficiente. Los vectores plasmídicos controlados por los promotores de T7 y CMV introducidos en las líneas celulares de mamífero, dieron lugar a la síntesis y autoprocesamiento proteolítico de la poliproteína codificada en la ORF 1. Se comprobó mediante un ensayo indirecto que la RpRd codificada en estas construcciones es funcional, sin embargo no se observó la síntesis del RNA intermediario de polaridad negativa, requerido para la replicación del genoma, para la síntesis del RNA subgenómico y por tanto, para la síntesis de las proteínas estructurales y el ensamblaje. A pesar de no haberse logrado un rescate eficiente, la metodología descrita en este trabajo, basada en el análisis funcional de los clones desde la perspectiva del ciclo replicativo ha posibilitado conocer qué fases ocurren con normalidad y cuáles no, acercándonos a las posibles causas del fallo en los rescates y sentando las directivas de trabajo futuro para los próximos ensayos