Identificación y estudio de las interacciones virus-célula del vesivirus de conejo (RaV)

Abstract

Los calicivirus son virus RNA de cadena sencilla y polaridad positiva que actúan como agentes patógenos en animales y humanos. El rango de huésped y el tropismo celular, así como el desarrollo de la infección, dependen en gran medida de la interacción con proteínas del huésped. En la presente memoria de tesis doctoral se describen las estrategias desarrolladas para la identificación de proteínas celulares que interaccionan con secuencias próximas a los extremos 5’ y 3’ del genoma del RaV y con las proteínas virales NS5, NS6/7 y VP1 del mismo virus. Para el estudio de las interacciones RNA viral-proteína celular se desarrolló una cromatografía de afinidad a RNA biotinilado utilizando extractos citoplasmáticos de células susceptibles y permisivas a la infección por RaV, que fueron incubados con RNAs sintéticos que presentaban secuencias de los extremos del genoma del virus. Las proteínas purificadas se analizaron e identificaron por espectrometría de masas. En total se consiguieron identificar 28 proteínas que presentaban diferente afinidad por secuencias del extremo 3’ o 5’. Para la identificación de las interacciones proteína viral-proteína celular se generaron líneas celulares modificadas establemente que expresaran, de manera independiente, las proteínas virales NS5, NS6/7 y VP1 de forma inducible y fusionadas a una etiqueta peptídica (C-TAP) para la purificación por afinidad en tándem (TAP). Se purificaron proteínas celulares unidas a NS5 y VP1, que fueron analizadas e identificadas por espectrometría de masas. En conjunto se identificaron 5 proteínas celulares capaces de interaccionar con VP1 y 3 con NS5. Al ser el RaV uno de los pocos modelos de calicivirus que puede ser propagado en cultivos celulares, se pudo estudiar la función de las proteínas PABP y hnRNPK en la infección. La proteína PABP, identificada por su interacción con secuencias próximas al extremo 3’ del genoma del RaV, fue silenciada en cultivos celulares y la posterior infección dio lugar a un descenso en el título viral, lo que indica un papel relevante de esta proteína celular en la propagación del virus. La proteína hnRNPK se identificó por su interacción con secuencias de la región 5’ del genoma del RaV, y el silenciamiento de su expresión causó un aumento del título viral, sugiriendo que esta proteína juega un papel negativo en la propagación del RaV. Con los resultados obtenidos en esta tesis doctoral se abren nuevas vías para el estudio de los procesos moleculares de replicación de RNA, traducción y formación de nuevas partículas virales en la infección por calicivirus, así como para el desarrollo de estrategias antivirales basadas en la acción de proteínas celulares durante la infección