Caracterización de la ruta de señalización de la quinasa snf1 y su relación con otras vías de señalización en la levadura kluyveromyces lactis

Abstract

La represión por glucosa afecta a la expresión de los genes que participan en la utilización de otras fuentes alternativas de carbono y energía. En levaduras, el elemento clave de la ruta de represión por glucosa es el complejo de la proteína quinasa SNF1. Snf1 pertenece a una familia de serina/treonina proteínas quinasas, muy conservadas en todos los organismos eucariotas, cuya función principal es el mantenimiento de la homeostasis celular. Además esta quinasa participa en otras rutas de señalización que permiten a las células adaptarse a diferentes situaciones de estrés. En este trabajo se ha estudiado la regulación por fuente de carbono de la ruta de señalización SNF1 utilizando como modelo la levadura Kluyveromyces lactis. En la primera parte del presente trabajo hemos caracterizado el complejo KlSNF1 y cómo actúa sobre los factores de transcripción KlCat8 y KlSip4. Para ello se han analizado mutantes y se ha estudiado la regulación y localización subcelular de los componentes en presencia de diferentes fuentes de carbono. Encontramos que una fracción de la quinasa Snf1 está activada y presente en el núcleo en células crecidas en etanol pero también bajo condiciones de represión. En esta última condición las subunidades ß y ¿ permanecen citosólicas. Se ha estudiado como tiene lugar la activación de la ruta identificando dominios y aminoácidos esenciales en la quinasa Snf1 y de los dos factores de transcripción. También se ha estudiado la especificidad de KlCat8 y KlSip4 por los elementos CSRE reguladores de los promotores de los genes que regulan, encontrando que reconocen variantes diferentes. Esto puede explicar por qué ambos factores son esenciales para la utilización de etanol en esta levadura. Finalmente, se han caracterizado las quinasas y la fosfatasa responsables de la activación y desactivación del complejo SNF1 en esta levadura. En la segunda parte del trabajo hemos estudiado la función del gen KlGPD1 que codifica la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+ (KlGpd1). Este enzima pertenece a la ruta de síntesis de glicerol y participa en el mantenimiento del balance redox y en la respuesta celular en condiciones de estrés osmótico. KlGpd1 es esencial durante el crecimiento en etanol y al estudiar a qué nivel actúa hemos encontrado que regula la activación del factor KlSip4 de la ruta de señalización de la quinasa KlSNF1. Hemos encontrado que además KlGpd1 regula la expresión de genes que participan en el mantenimiento del balance redox como KlADH3. También hemos investigado la activación de la síntesis de glicerol en condiciones de estrés osmótico y su dependencia de la MAP quinasa Hog1. En relación a la regulación de KlGpd1 hemos encontrado que el gen KlGPD1 se expresa formando dos transcritos que codifican proteínas que difieren en su extremo N-terminal. Mediante el estudio de mutantes in vitro se han identificado y caracterizado las regiones importantes para la función y localización subcelular del enzima encontrándose que presenta una doble localización citosólica y peroxisomal. Finalmente, hemos demostrado que las cepas deficientes en la deshidrogenasa KlGpd1 desvían el metabolismo produciendo etanol, lo cual tiene repercusiones importantes desde el punto de vista biotecnológico