Aislamiento y caracterización de genes de biosíntesis del antibiótico glicopeptídico vancomicina

Abstract

En esta Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el estudio de la ruta de biosíntesis del antibiótico glicopeptídico vancomicina. La importancia de este antibiótico se centra en su actividad antibiótica frente a bacterias Grampositivas frente a las que otros antibióticos de uso tradicional, como los antibióticos beta-lactámicos, no resultan efectivos. Para llevar a cabo este estudio se procedió a la construcción de una genoteca del ADN cromosómico del microorganismo productor de vancomicina, Amycolatopsis orientalis, utilizando como vector de clonación el cósmido bifuncional para Streptomyces y Escherichia coli pKC505. El tamaño medio de los insertos del ADN cromosómico en dicho cósmido estaba comprendido entre 18 y 30 kb. Se generaron 3300 clones en la genoteca, por lo que teniendo en cuenta que el tamaño del genoma de este microorganismo está próximo a las 10 Mb, la representatividad lograda en la genoteca ronda el 99%. Para la localización de los genes implicados en la ruta de biosíntesis del antibiótico glicopeptídico vancomicina, se procedió al análisis de la genoteca mediante hibridación in situ. Para ello se utilizaron tres tipos de sondas, tanto homólogas como heterólogas. En primer lugar se utilizó una sonda de genes de biosíntesis de deoxiazúcares de antibióticos; en concreto, los genes mtmD y mtmE, implicados en las dos primeras reacciones de la ruta de biosíntesis del antibiótico antitumoral mitramicina. Las reacciones llevadas a cabo por los enzimas codificados por estos dos genes son comunes a la mayoría de las rutas de biosíntesis de deoxiazúcares presentes en antibióticos. La presencia del deoxiazúcar L-vancosamina en la molécula de vancomicina justificaba por tanto la utilización de este tipo de sondas. La segunda sonda utilizada estaba implicada en sistemas de tipo ABC, implicados en exportación y resistencia a antibióticos en los microorganismos productores. Esta sonda se amplific