Enfermedad de Parkinson: caracterización de la región 3UTR de los genes SNCA y LRRK2 y del miRNOMA de tejido cerebral y plasma sanguíneo

Abstract

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno del movimiento, neurodegenerativo, progresivo y crónico, que afecta al 1-2% de los mayores de 60 años. Los signos motores que acompañan a la enfermedad son debidos a la pérdida de neuronas dopaminérgicas (ND) en la pars compacta de la Sustantia nigra (SNpc) y a la consiguiente disminución de los niveles de dopamina en el estriado. En la EP, intervienen numerosos procesos fisiológicos y celulares y son varios los mecanismos de interacción entre los diferentes genes: función mitocondrial, estrés oxidativo, reciclaje de vesículas sinápticas¿ Los microRNAs (miRNAs) son ARNs no codificantes de unos 22-24 nt que regulan la expresión génica a nivel post-trascripcional. Intervienen en la regulación de procesos del desarrollo, morfogénesis y adaptación del organismo a cambios, estando su desregulación asociada a múltiples procesos patológicos, incluyendo los tumorales y los neurodegenerativos Uno de los objetivos principales del proyecto, era el estudio de la variabilidad genética en la región 3¿UTR de los genes SNCA y LRRK2 y su posible implicación como factor de riesgo o protección de la enfermedad. El segundo objetivo principal se dirigió a la determinación del perfil de expresión de miRNAs en plasma sanguíneo y tejido cerebral proveniente de pacientes con EP y de donantes sanos. Estudios gen SNCA: La variación genética en la región 3¿UTR se estudió en 752 EP de la población asturiana y 480 controles sanos y se describieron un total de seis variantes. Únicamente rs356165 mostraba una asociación con la enfermedad, replicándose en una cohorte de Navarra. El alelo de riesgo G parece modificar la edad de inicio. Se han descrito 4 isoformas predominantes en el gen SNCA: SNCA-140, -126, -112 y -98 y nos propusimos cuantificar su expresión mediante PCR semicuantitativa a tiempo real. Utilizamos ARN obtenido de tejido cerebral de tres regiones (SN, CB y CO) de donantes con EP (N=9) y sin patología cerebral (N=6). La comparación de los niveles de expresión relativa de los transcritos en la SN no mostró diferencias entre pacientes y donantes sanos, tampoco la comparación según el genotipo de rs356165. En CB encontramos diferencias entre pacientes y controles para los niveles de expresión de los transcritos cortos SNCA-112 y SNCA-98. Estudios gen LRRK2: La variación en la región 3¿UTR del gen LRRK2 se determinó en la cohorte de Asturias. Hallamos doce variantes, mostrando únicamente el rs66737902 diferencias estadísticas en la comparación de las frecuencias genotípicas y alélicas entre pacientes y controles. Nos planteamos investigar si la asociación del alelo rs66737902-C y la EP podría ser explicada por un efecto sobre la unión de algún miRNA. Seleccionamos a miR-138.2-3p como candidato y realizamos ensayos de expresión renilla-luciferasa en células HEK-293 para determinar si ejercía un efecto en la expresión de la 3¿UTR de LRRK2. No encontrando diferencias significativas entre las células transfectadas o no con el pre-miR-138.2-3p. Cuantificamos los niveles de ARN de LRRK2 en el tejido cerebral y encontramos diferencias en la expresión relativa de LRRK2 en la SN de los pacientes según fuesen o no portadores del alelo de riesgo rs66737902 C. Expresión de miRNAs en tejido cerebral: Estudiamos la expresión de miRNAs en la SN de los donantes de tejido, observamos que los enfermos presentaban una menor expresión global de miRNAs. Se seleccionaron 7 miRNAs con expresión diferencial: miR-369-3p, miR-450b-3p, miR-136, miR-337-5p, miR-508-5p, miR-548d y miR-579 y se ensayaron con sondas TaqMan individuales en las 14 muestras de SN. Únicamente miR-136 mostró diferencias significativas en los niveles de expresión (p=0,025). Los niveles de los 7 miRNAs candidatos se determinaron también en CB y CO no observando diferencias entre pacientes y controles. Realizamos una predicción de las posibles rutas fisiológicas relacionadas con la EP que podrían ser reguladas por miR-136, entre ellas se encuentran varias previamente relacionadas con la EP, como las de señalización de la insulina, TGF-ß o MAPK. Expresión de miRNAs en plasma sanguíneo: Estudiamos el perfil de expresión de los 360 miRNAs humanos mejor caracterizados en el plasma de 31 pacientes con EP y 25 controles sanos. Tras analizar los resultados obtenidos en las TLDAs, los siguientes miRNAs estaban sobre o infra-representados en el plasma de los pacientes: miR-125a-3p, -137, -181c, -193a-3p, -196b, -331-5p y -454. Estos miRNAs fueron cuantificados individualmente en cada plasma de pacientes y controles. Únicamente miR-331-5p mostró diferencias significativas entre los dos grupos con una expresión relativa >20X en EP frente a controles. La expresión de miR-331-5p se cuantificó en el grupo con EA, hallando niveles similares a los del grupo control y menores que los hallados en los EP.