Nuevas técnicas de manipulación genética y caracterización de mutantes en Flavobacterium psychrophilum

Abstract

La "enfermedad del agua fría" es una de las patologías que más problemas sanitarios y costes económicos genera en la acuicultura de salmónidos de todo el mundo. El agente etiológico de esta enfermedad es la bacteria Gram-negativa Flavobacterium psychrophilum. Por el momento, las dificultades que conllevan su cultivo y manipulación genética han hecho que los mecanismos implicados en la patogénesis sean, en su mayor parte, desconocidos. En el trabajo que aquí se presenta se han abordado dos de estos aspectos: el estudio de factores de virulencia y el desarrollo de nuevas técnicas de manipulación genética. Con el fin de identificar algunos de los genes implicados en el proceso infeccioso desarrollado por esta bacteria, se ha obtenido una genoteca de mutantes mediante transposición basada en el elemento móvil Tn4351, lo cual ha permitido interrumpir un total de 347 loci. De todos ellos, se seleccionaron veintidós mutantes para ser analizados de acuerdo a tres características fenotípicas, en relación a la cepa parental: movilidad, actividad proteolítica extracelular y virulencia. Dos de estos mutantes mostraron un menor grado de virulencia y varios rasgos fenotípicos alterados. Los genes interrumpidos, denominados fptA y wzxE, codifican sendas proteínas probablemente implicadas en el transporte de polisacáridos y el antígeno O a través de la membrana celular interna. Por otro lado, la técnica de mutagénesis dirigida mediante recombinación homóloga permitió la interrupción del gen ftkA, que codifica una tirosina quinasa probablemente involucrada en la regulación de la síntesis de exopolisacáridos. Asimismo, este mutante exhibió una atenuación considerable de la virulencia y un fenotipo pleiotrópico. En la presente memoria también se muestran resultados relacionados con la construcción de un vector para el estudio de la actividad promotora, basado en la expresión del gen gfpmut3, codificante de la GFP. La utilización de este vector ha permitido obtener datos relativos a la regulación de la expresión, entre otros, de dos genes de especial relevancia en esta bacteria, como son los genes que codifican las metaloproteasas extracelulares Fpp1 y Fpp2. Finalmente, con el fin de aumentar el número de técnicas de mutagénesis disponibles para esta bacteria, se ha implementado un nuevo sistema de mutagénesis por deleción mediado por la meganucleasa I-SceI, lo cual ha dado lugar a la deleción del gen fcpB, que codifica una cistein peptidasa homóloga a la exotoxina pirogénica estreptocócica B (SpeB) de Streptococcus pyogenes. Sin embargo, bajo las condiciones ensayadas, el gen fcpB no parece estar implicado en el proceso infeccioso desarrollado por esta bacteria. Este sistema abre así nuevas vías para el estudio de la función génica y de los factores implicados en la patogénesis de F. psychrophilum.