Síntesis y evaluación de nanomateriales metálicos fluorescentes como marcadores en el desarrollo de inmunoensayos

Abstract

En la actualidad la Nanociencia está siendo de vital importancia para el desarrollo, crecimiento y mejora de la calidad de numerosos y muy variados sectores como la electrónica, la industria textil, energías renovables, medicina, bioanálisis, control ambiental, etc. Así, la Química Analítica (Ciencia al servicio de los problemas de la sociedad) encuentra en esta Ciencia emergente diversas líneas de de actuación, como son: - La investigación de nuevas metodologías de análisis basadas en el empleo de nanomateriales. - El desarrollo de estrategias para el control de la síntesis y caracterización de nuevas nanopartículas. - La investigación de nuevas vías para el marcaje de analitos de interés con estas nanoestructuras y su posterior caracterización y análisis. También cabe remarcar la emergente y urgente demanda por parte del sector nanotecnológico de: - El desarrollo de procesos sintéticos sencillos, fáciles de controlar y escalar y extensibles para su aplicación a la síntesis del mismo nanomaterial con distinto núcleo metálico, así como la búsqueda de nuevos nanomateriales multifuncionales. - El desarrollo y mejora de las técnicas de caracterización de nanomateriales, haciendo que cada vez sean más eficaces y fiables, ya que una buena caracterización estructural y de composición es esencial a la hora de intentar comprender mejor las propiedades que presentan estos materiales y establecer relaciones estructura-propiedad. Por otro lado, dentro de la Química Analítica, la rama del bioanálisis está experimentando un creciente desarrollo debido a la gran demanda de métodos de análisis cada vez más sensibles, fiables y rápidos que nos aporten la mayor información posible. Así, una de las técnicas de bioanálisis más empleadas, en la que siempre se intenta innovar y que reúne dichas características, son las metodologías de análisis inmunoquímico. De hecho, en este campo, la detección fotoluminiscente ofrece una serie de ventajas que confieren a los inmunoensayos una elevada sensibilidad analítica. Por ello, el desarrollo de nuevas generaciones de fluoróforos (p.e. quantum dots o QDs y nanoclustes o NCs) con propiedades que mejoren y/o solventen los problemas que presentan los fluoróforos convencionales (baja fotoestabilidad, cortos desplazamientos de Stokes, tiempos de vida media pequeños) es especialmente apreciado. En este contexto, el objetivo general que se plantea en la presente Tesis Doctoral es: Desarrollo de nuevas estrategias sintéticas, caracterización y aplicación de nanomateriales luminiscentes como marcadores en inmunoensayos cuantitativos. Este propósito global se persiguió a través de los siguientes objetivos específicos consiguiéndose los resultados que se muestran a continuación: 1. Desarrollo de inmunoensayos fluorescentes cuantitativos basados en CdSe/ZnS quantum dots. Desde las primeras publicaciones sobre las propiedades y síntesis de QDs, hace ya dos décadas, muchos han sido los avances realizados en este campo tanto en estudios fundamentales como en las posibles aplicaciones de estos nanomateriales. Así, han sido propuestos diferentes esquemas de bioensayos en los que se utilizan QDs como marcadores aprovechando las especiales propiedades optoelectrónicas de estos nanocristales. Hasta el comienzo de la presente Tesis Doctoral en la literatura se podían encontrar diversos formatos de bioensayos e inmunoensayos basados en QDs, tales como sensores directos de (bio)moléculas basados en el enaltecimiento/apagado de la fluorescencia del QD; ensayos de transferencia de energía (FRET o BRET); inmunosensores electroquímicos; ensayos de western blotting, etc. Sin embargo, existían muy pocos trabajos en los que se empleasen los QDs como marcas directas para el desarrollo de inmunoensayos cuantitativos. Por este motivo en el primer capítulo de la presente Tesis Doctoral se llevó a cabo el diseño y completo desarrollo de un inmunoensayo competitivo fluorescente basado en QDs. Para ello, se escogió como analito modelo la Progesterona, una hormona cuyos niveles en leche de ganado bovino pueden ser empleados para determinar el momento fértil de la vaca y optimizar los tiempos de fecundación de la misma. Por otro lado, con el fin de demostrar que el formato de inmunoensayo desarrollado es una plataforma general de análisis aplicable a cualquier compuesto de interés, se aplicó con éxito dicho esquema de inmunoensayo a la determinación de Melamina en leche fórmula para bebés (esta sustancia es un adulterante empleado para incrementar de forma aparente el contenido de proteína de los alimentos). De este modo, queda puesto de manifiesto la posibilidad de realizar ensayos multiparamétricos (análisis de varios analitos a la vez) con la plataforma general de inmunoensayo basado en QDs aquí desarrollado. 2. Evaluación del empleo de CdSe/ZnS quantum dots como marcas elementales en inmunoanálisis. Teniendo en cuenta el carácter metálico de estas nanopartículas junto con la necesidad de desarrollar ensayos cada vez más sensibles y fiables para la determinación de biomoléculas a bajos niveles de concentración, en este segundo objetivo parcial se exploró el uso de los QDs como marcas elementales en inmunoensayos empleando como detector el ICP-MS. Este detector es ampliamente empleado en la identificación y cuantificación de elementos traza (endógenos o exógenos o posibles contaminantes) en una gran variedad de campos de aplicación como el medioambiental, el geológico, el clínico o el industrial. Sin embargo, no ha sido hasta esta última década cuando se ha iniciado la investigación en el empleo del ICP-MS como detector en inmunoensayos en la creencia de obtener unas poderosas ventajas de la unión de estas dos potentes técnicas analíticas. Con la investigación llevada a cabo en este objetivo se consiguió poner de manifiesto por un lado el potencial de los QDs como marcas elementales y, por otro, las ventajas que el ICP-MS puede aportar como detector de inmunoensayos. Para ello, se utilizó con éxito el inmunoensayo previamente desarrollado para la determinación de progesterona en leche de ganado vacuno. 3. Síntesis y caracterización de una nueva generación de fluoróforos nanostructurados: nanoclusters metálicos de plata. Actualmente existe una gran demanda tanto de nuevas estrategias sintéticas para la producción de nuevos nanomateriales con propiedades únicas como del desarrollo de nuevas marcas que mejoren las características analíticas de los inmunoensayos y/o técnicas de bioanálisis in vivo (p.e. técnicas de imagen). De este modo, en un intento de aunar estos retos, en este tercer objetivo se planteó la investigación de la síntesis y caracterización de nanoclusters de plata. Los NCs son unos nanomateriales emergidos recientemente y que presentan un futuro prometedor como marcadores en diversas técnicas bioanalíticas y en análisis in vivo. Sin embargo, todavía se requieren estudios fundamentales que establezcan relaciones estructura-propiedad-aplicación y en concreto, en esta Tesis Doctoral se ha estudiado los efectos que tiene la irradiación continuada de luz UV sobre las propiedades ópticas de los nanoclusters de plata. Cabe mencionar que a lo largo de la presente Tesis Doctoral y para conseguir llevar a cabo con éxito los objetivos parciales anteriormente citados se desarrollaron diversas estrategias analíticas para: # la purificación y caracterización de trazadores (biomoléculas marcadas en inmunoensayos) - Marcaje de anticuerpo: purificación por cromatografía de exclusión por tamaños y caracterización mediante ensayo ELISA - Marcaje de antígeno: purificación por UHF y caracterización mediante Test de Bradford # la caracterización de los cambios nanoestructurales que se producen a lo largo de la síntesis de nanoclusters de plata y tras el proceso de irradiación UV mediante el empleo de la técnica de separación Asymmetric Flow Field-Flow Fractionation acoplada en línea a detectores moleculares (UV/Vis y fluorescencia) y detector elemental (ICP-MS). Por todo ello, esta Tesis Doctoral abarca desde la síntesis, purificación y caracterización de nanomateriales (QDs y NCs), hasta la aplicación de los mismos como marcas (fluorescentes y elementales) al desarrollo de inmunoensayos competitivos para la determinación de moléculas pequeñas (haptenos) de interés, pasando por la realización de estudios fundamentales que afectan a las propiedades únicas de estos nanocristales, así como el desarrollo de diversas estrategias para el marcaje, purificación y caracterización de biomoléculas (anticuerpos y/o conjugados hapteno-BSA) con QDs.