Ingeniería metabólica aplicada al incremento de la producción del antitumoral mitramicina en Streptomyces argillaceus

Abstract

La mitramicina (MTM), es un compuesto policetónico antitumoral producido por Streptomyces argillaceus, que está constituido por un aglicón tricíclico con dos cadenas alifáticas, el cual está glicosilado con un trisacárido y un disacárido. La biosíntesis del aglicón se inicia por la condensación de 10 unidades de malonil-CoA que darán lugar a la cadena policetónica, que posteriormente sufrirá modificaciones para dar lugar al intermediario tetracíclico al que se le adicionarán secuencialmente por reacciones de glicosilación cinco desoxiazúcares sintetizados a partir de glucosa-1-P además de sufrir diversas reacciones de oxidación y reducción que darán lugar al compuesto final. El objetivo del presente trabajo fue incrementar los metabolitos precursores malonil-CoA y /o glucosa-1P en S. argillaceus con el fin de aumentar la producción de MTM. Se demostró que mediante la sobreexpresión en S. argillaceus de una fosfoglucomutasa codificada por el gen pgm de S. coelicolor o de la acetil-CoA carboxilasa codificada por los genes ovmGIH de la agrupación de genes de biosíntesis de oviedomicina, se podía incrementar la concentración intracelular de glucosa-1P y de malonil-CoA, respectivamente. Por otro lado, se clonaron los genes glgCa que codifica la ADP-glucosa pirofosforilasa de S. argillaceus y aftAa que codifica la diacilglicerol aciltransferasa, y se pudo demostrar que al inactivarlos se podía incrementar la concentración intracelular de glucosa-1P/glucosa6P y de malonil-CoA/acetil-CoA, respectivamente, Estas modificaciones permitieron aumentar la producción de MTM, obteniéndose los mejores resultados combinando todas las estrategias ensayadas en la misma cepa. Algunas de estas estrategias se aplicaron con éxito para incrementar la producción de cuatro derivados de mitramicina que presentan mejoras en sus propiedades farmacológicas (desmicarosil-mitramicina, desmicarosil-3D-ß-D-digitoxosilmitramicina, mitramicina SK y mitramicina SDK), y también para mejorar la producción de dos compuestos derivados de malonil-CoA aún sin caracterizar, producidos por S. argillaceus. Además, algunas de las estrategias se aplicaron también a la mejora de la producción de otros compuestos bioactivos producidos por otros Streptomyces. Por otro lado, se caracterizó el gen mtmL de la agrupación de genes de biosíntesis de MTM, que codifica una proteína similar a acil-CoA ligasas. Se había propuesto que este gen podría estar involucrado en facilitar el aporte de metabolitos precursores para la biosíntesis de MTM. A través de la inactivación de este gen y caracterización de la cepa mutante obtenida, junto con experimentos de coexpresión de mtmL con otros genes de biosíntesis de MTM, se ha podido determinar que mtmL está involucrado en las etapas iniciales de la biosíntesis de MTM, participando en la formación del tercer o cuarto anillo del aglicón. Además estos experimentos han permitido definir el mínimo número de genes necesarios para la biosíntesis de 4-demetil-premitramicinona, que es el primer intermediario tetracíclico estable en la biosíntesis de MTM.