Enfermedad de Parkinson: papel de la variación genética en regiones reguladoras de la expresión de los genes de Parkina y microRNAs asociados

Abstract

La EP es una enfermedad neurodegenerativa que afecta en torno al 2% de la población por encima de los 65 años de edad. Se caracteriza por una pérdida de neuronas dopaminérgicas, principalmente en la sustancia nigra. Los individuos afectados por la EP se caracterizan por la presencia de una serie de manifestaciones motoras típicas como pueden ser el temblor, la bradicinesia, rigidez y/o inestabilidad postural entre otros; así como no motoras causadas por el propio desarrollo de la enfermedad o como resultado secundario del tratamiento farmacológico. Los criterios utilizados para el diagnóstico de la EP son principalmente clínicopatológicos, aunque su diagnóstico solo puede ser definitivo tras la necropsia y el estudio anatomopatológico del tejido cerebral. La pérdida de neuronas dopaminérgicas en la SN y la derivada pérdida de DA en el estriado asociadas al desarrollo de la EP tiene un origen desconocido a pesar de los grandes avances realizados en los últimos años. Sin embargo, se ha establecido la implicación de distintos factores ambientales así como la importancia de un componente hereditario o genético en el riesgo de desarrollar la enfermedad. El estudio de familias con varios afectados para la EP llevó al descubrimiento de loci/genes donde la presencia de variación se ha asociado al desarrollo de la enfermedad, sabiéndose hoy que un 10% de los casos de EP descritos tienen un origen genético. El estudio de estos genes y las proteínas que codifican han llevado a la identificación de diferentes mecanismos y rutas moleculares que podrían intervenir en la muerte celular y por tanto en el desarrollo de EP. Así, actualmente sabemos que las vías fisiopatológicas que conducen al desarrollo de la enfermedad son complejas e interaccionan unas con otras. Las moléculas implicadas son muchas y con diferentes funciones; hay moléculas implicadas en la dinámica de los microtúbulos (PINK1, LRRK2), otras forman parte de la ruta ubiquitin-proteasoma (PARK2) y en otros casos, desempeñan sus funciones a nivel lisosomal (PINK1, alpha-sinucleina). Además, algunas de las vías de neurodegeneración son comunes a la enfermedad de Parkinson hereditaria y a la enfermedad esporádica. Otro paso importante para el conocimiento de las vías implicadas en el desarrollo de las enfermedades neurodegenerativas ha sido el descubrimiento de los mecanismos epigenéticos reguladores de la expresión protéica, tanto pre- como post-transcripcional. Esto ha abierto la puerta al desarrollo de nuevas estrategias terapeúticas centradas en el uso de miRNAs o nuevos fármacos que modulan los procesos de metilación regulando así la expresión génica. Como objetivo general nos planteamos el analizar las frecuencias de la variación incluyendo las regiones reguladoras y el establecimiento de las correlaciones genotipo-fenotipo en el gen PRKN y varios miRNAs relacionados en el riesgo de desarrollar enfermedad de Parkinson. En el estudio se incluyeron 1027 pacientes españoles diagnosticados de EP (muestra que incluye pacientes de EP de inicio temprano y tardío) no emparentados entre sí. Se analizó, además, una población control de 860 individuos sin historial de enfermedad neurológica. Para cada individuo se recopiló la información clínica relevante así como una muestra de ADN extraída a partir de sangre periférica. Adicionalmente se recogieron muestras de 3 áreas de tejido cerebral de 5 pacientes de EP y 2 controles sanos para el estudio epigenético. El gen de PRKN así como los miRNAs seleccionados, fueron analizados en un conjunto de pacientes seleccionados aleatoriamente, mediante secuenciación automática, MLPA, dHPLC o PCRRFLP según requerimiento del estudio, para sus regiones codificantes y reguladoras. En los casos donde se encontró una variante potencialmente patogénica o desconocida se procedió al análisis de las frecuencias en población control. Usamos herramientas bioinformáticas para la caracterización del efecto de las nuevas variantes en el ARN mensajero o la proteína codificada por el gen, así como el efecto putativo sobre la expresión génica en aquellas variantes localizadas en las regiones reguladoras. Se realizaron estudios de funcionales de expresión mediante vectores reporteros de luciferasa para aquellas variantes localizadas en las regiones reguladoras con frecuencias significativamente diferentes entre controles sanos y pacientes de EP. El método de conversión de bisulfitos se empleó para el análisis del patrón de metilación en las muestras procedentes de tejido cerebral. El análisis estadístico de las frecuencias de las diferentes variantes halladas y su correlación con el fenotipo clínico, así como el análisis de datos de expresión génica se realizaron mediante el paquete estadístico SPSS, recurriendo al test de Chi-cuadrado con corrección de Yates, test exacto de Fisher, Tstudent o ANOVA en función de las necesidades. De entre los resultados presentados en este estudio cabe destacar el análisis de las regiones 3¿UTR y 5¿UTR del gen de PRKN, además de su región codificante y promotora. El análisis de la región codificante de PRKN confirma que la presencia de mutaciones puntuales en homocigosis o heterocigosis compuesta en individuos de edad de inicio temprano es un factor de riesgo en el desarrollo de PJAR pero no en EP esporádico. También observamos que el análisis mediante MLPA en este gen resulta imprescindible en casos de EP de inicio temprano portadores heterocigotos de mutaciones en la región codificante debido a la alta frecuencia de reordenamientos hallados. El análisis de la 3¿UTR nos llevó a la identificación de un polimorfismos (*94A>G) cuyo alelo G presentaba una frecuencia mayor en controles que en pacientes de EP sugiriendo un efecto protector de éste sobre el desarrollo de EP; sin embargo no se ha podido establecer una causalidad directa entre este efecto protector y el propio polimorfismo. Además incluimos el análisis de la región promotora de PRKN hallando un posible efecto modulador sobre la edad de inicio de EP del genotipo GG del polimorfismo - 258T>G. El análisis del estado de metilación del promotor de PRKN en tejido cerebral procedente de pacientes de EP comparados con tejido procedente de controles sanos reveló una ausencia de asociación de este sobre la regulación del gen PRKN y por tanto con el desarrollo de EP, siendo el nuestro el primer ensayo de este tipo en tejido cerebral para el gen PRKN en pacientes de EP. Finalmente, no se encontró relación entre la variabilidad presente en los genes codificantes de los miRNAs relacionados con EP de la familia -133 y -433 o sus genes diana (PITX3 y FGF20, respectivamente) y el riesgo de desarrollar EP en nuestra población.