Purificación y caracterización de enzimas implicados en la biosíntesis del antitumoral mitramicina por streptomyces argillaceus ATCC 12956

Abstract

La mitramicina es una policétido antitumoral producido, entre otros, por Streptomyces argillaceus ATCC 19256, y que pertenece a la familia de antibióticos y antitumorales del ácido aureólico. Su estructura está compuesta por un aglicón tricíclico que presenta un discárido y un trisacárido en las posiciones 2 y 6, respectivamente. En el presente trabajo se han purificado dos de los enzimas de modificaciones postPKS de mayor interés dentro de la ruta, la monooxigenasa MtmOIV y la C-metiltransferasa MtmMII. MtmOIV es un monómero de 57 kDa dependiente de FAD, responsable de la apertura oxidativa del cuarto anillo del aglicón a través de una oxidación de Baeyer-Villiger. Su actividad in vitro da lugar a la generación de dos isómeros de un compuesto de estructura tricíclica, similar a mitramicina, pero con una cadena alifática más corta que la presente en el producto final. Sin embargo, MtmOIV resulta esencial para la actividad biológica del compuesto, puesto que su producto es el primer intermediario bioactivo de la ruta. MtmMII es un monómero de 36 kDa, dependiente de NADPH y S-adenosil metionina. Estudios cinéticos mostraron que el enzima cataliza la introducción de un grupo metilo en el C7 del aglicón mediante un mecanismo bi bi obligatorio. Análisis estructurales realizados mediante estudios de reconocimiento del plegamiento demostraron que MtmMII es una a/b proteína con dos dominios claramente definidos, presentando el dominio C-terminal un plegamiento en forma de Rossmann Fold, responsable de la unión del NADPH y muy similar al de otras metiltransferasas de la misma familia. MtmOIV y MtmMII mostraron una elevada especificidad de sustratro, siendo incapaces de catalizar sus reacciones sobre compuestos estructuralmente similares. Por otro lado se realizaron estudios de localización en células tumorales, así como análisis fisicoquímicos y ensayos de unión a ADN eucariótico tanto de la mitramicina como de [...]