Desarrollo de metodologías analíticas para el estudio del metabolismo del azufre utilizando isótopos estables enriquecidos

Abstract

La alteración intencionada de la composición isotópica de un elemento dado en un organismo vivo permite obtener información metabólica del elemento. La composición isotópica del azufre varía en la naturaleza por lo que para seguir la pista del azufre en un ser vivo utilizando un trazador marcado isotópicamente, la cantidad de trazador metabólico utilizada debe ser lo suficientemente elevada como para alterar la composición isotópica del azufre por encima de los límites de variabilidad natural. Los equipos ICP-MS multicolectores permiten realizar medidas de relaciones isotópicas de azufre con excelentes precisiones instrumentales, necesarias para la determinación de variaciones isotópicas naturales. Tradicionalmente, los estudios de metabolismo con trazadores de azufre se han llevado a cabo utilizando el isótopo radiactivo de azufre-35. En los últimos años, la creciente popularidad del ICP-MS ha acelerado el uso de isótopos estables para estudios de metabolismo. En este sentido, la baja abundancia isotópica que presentan los isótopos estables azufre-33 y azufre-34 en el azufre natural, los hace muy adecuados para su uso como trazadores. Sin embargo, hasta el comienzo de la presente Tesis Doctoral, el número de estudios de metabolismo utilizando isótopos estables de azufre que empleasen ICP-MS era muy escaso. Además, no se había descrito ninguna aplicación con trazadores múltiples de azufre. La determinación de azufre por ICP-MS puede ser usada como una herramienta genérica para la detección y cuantificación de péptidos y proteínas. Ningún estudio de metabolismo de proteínas en mamíferos utilizando isótopos estables enriquecidos de azufre había sido descrito con anterioridad. Estos estudios requieren la síntesis previa de cisteína y/o metionina marcada con el isótopo enriquecido dado que los mamíferos no son capaces de sintetizar estos aminoácidos y necesitan obtenerlos a través de la alimentación. Particularmente, se podría administrar levadura marcada con isótopos estables de azufre como alimento por vía oral para realizar estudios de metabolismo del azufre evitando los riesgos derivados de la exposición a la radiación. En este contexto, la presente Tesis Doctoral se centró en el desarrollo de metodologías analíticas para el estudio del metabolismo del azufre utilizando isótopos estables enriquecidos. Este objetivo general se abordó a través de las investigaciones que se resumen a continuación: 1. Estudios de variabilidad natural de la composición isotópica de azufre mediante ICP-MS multicolector. En primer lugar, se desarrolló un procedimiento directo para la medida de la variabilidad natural de la composición isotópica de azufre en muestras de cerveza mediante ICP-MS multicolector. Asimismo, se desarrolló una metodología analítica que permite realizar la medida de variaciones naturales en la composición isotópica de azufre a lo largo de un pelo mediante un sistema de ablación láser acoplado a un ICP-MS multicolector. 2. Preparación y caracterización de levadura marcada con azufre-34. Se preparó levadura marcada isotópicamente con azufre-34 en un medio de cultivo exento de azufre de abundancia natural. La levadura marcada se caracterizó tanto en composición isotópica como en concentración total de azufre mediante ICP-MS multicolector. A continuación, se evaluaron diferentes estrategias analíticas para la cuantificación de biomoléculas que contienen azufre mediante HPLC-ICP-MS. Se desarrolló un procedimiento basado en la deconvolución de perfiles isotópicos y el análisis por dilución isotópica inespecífica para la determinación simultánea de concentración y composición isotópica de azufre en especies individuales y se aplicó a la caracterización de la levadura marcada con azufre-34. 3. Estudios in vitro e in vivo del metabolismo del azufre utilizando isótopos estables enriquecidos. Se simuló in vitro una digestión gastrointestinal de la levadura marcada con azufre-34 y el hidrolizado se caracterizó mediante SDS-PAGE y HPLC-ICP-MS. Finalmente, se realizaron estudios con trazadores estables de azufre en animales de laboratorio utilizando levadura marcada con azufre-34. Se puede concluir que a lo largo de la presente Tesis Doctoral se han desarrollado metodologías analíticas novedosas para el estudio del metabolismo del azufre utilizando isótopos estables enriquecidos. En particular, la combinación del enriquecimiento isotópico en azufre-34 (utilizando azufre-34 como trazador metabólico) y la cuantificación absoluta de biomoléculas (utilizando azufre-33 como trazador de cuantificación) mediante HPLC-ICP-MS se podría establecer como una estrategia alternativa en estudios metabólicos de compuestos que contengan azufre en su estructura.