Expresión heteróloga y análisis funcional de proteínas virales y secuencias de RNA implicadas en la replicación del genoma del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo

Abstract

En este trabajo experimental se presentan datos sobre proteínas y secuencias de RNA implicadas en la replicación del genoma del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV) Se ha observado que la RNA polimerasa recombinante del RHDV es capaz de actuar in vitro sobre moldes heteropoliméricos de cualquier región genómica y polaridad, independientemente de que éstos presenten o no una secuencia de poli(A) en su extremo 3'. La reacción de polimerización da lugar a la formación de dos productos, uno similar al tamaño del molde empleado y otro de mayor tamaño que el molde de partida formado por una cadena de polaridad positiva y otra negativa unidas covalentemente Se ha determinado la existencia de una región mínima necesaria para que tenga lugar el inicio de la síntesis del RNA genómico de polaridad positiva, situada dentro de los 150 residuos más cercanos al extremo 3' de la banda complementaria al RNAg. El RHDV presenta en su extremo 5' una proteína unida de forma covalente. Esta proteína se ha expresado en un sistema heterólogo permitiendo realizar su estudio funcional. Esta proteína recombinante es capaz de incorporar un residuo nucleotídico en ausencia de un molde, en un proceso catalizado por la polimerasa viral en presencia de cationes divalentes como el Mn2+ o el Mg2+. Se ha identificado el aminoácido Tyr- 21 como el residuo responsable de la unión de la VPg el residuo nucleoídico El precursor 3CDpro-pol recombinante es catalíticamente activo pudiendo actuar in Vitro sobre la proteína VPg incorporando residuos uridililo y copiando moldes heteropoliméricos de RNA. Se ha comparado su actividad con el producto maduro 3Dpol al que da lugar observándose que es más eficiente en su actividad uridililadora que el producto maduro 3Dpol y que este es más eficaz como polimerasa que su precursor 3CDpro-pol.