Cuantificación absoluta de péptidos y fosfopéptidos mediante la integración de la espectrometría de masas elemental y molecular

Abstract

La Proteómica es la ciencia que estudia el conjunto completo de proteínas, que es lo que constituye el proteoma, expresadas a partir de un genoma concreto. Se calcula que en el ser humano el número proteínas supera el millón. Además, está ampliamente reconocido que las proteínas son las que realmente desarrollan las funciones vitales y forman la mayoría de los procesos celulares. Una de las principales causas de la variabilidad del proteoma, y por tanto de su complejidad, son las modificaciones post-traduccionales (PTMs). La fosforilación es una de las más importantes PTMs siendo un proceso dinámico y reversible controlado estrictamente por la acción combinada de proteínas (enzimas) quinasas y fosfatasas, que catalizan la incorporación y eliminación de un grupo fosfato a las proteínas, respectivamente, en respuesta a estímulos celulares o medioambienales. Actualmente, existe un gran interés en la mejora y desarrollo de estrategias que faciliten el estudio cualitativo y cuantitativo de las (fosfo)proteínas. En los últimos años, gracias al desarrollo de los métodos de ionización suave, el ESI y MALDI, la espectrometría de masas molecular se ha convertido en el método más importante para el análisis y caracterización de péptidos y proteínas. A pesar de que la identificación de las (fosfo)proteínas es importante en el conocimiento de sus funciones biológicas, la cuantificación absoluta de las mismas es crítica para la interpretación de los procesos celulares. Sin embargo, ésta cuantificación absoluta es menos frecuente y los métodos empleados hasta el momento requieren, mayoritariamente, la síntesis química de cada (fosfo)péptido. Por otra parte, la señal cuantitativa proporcionada por la espectrometría de masas elemental, ICPMS, puede jugar un papel fundamental en la proteómica cuantitativa. El ICPMS es una fuente de ionización robusta, cuya señal es directamente proporcional al número de átomos del elemento presentes en la muestra, es decir, la señal es independiente de la estructura de la molécula y de la matriz en la que se encuentre. Así, la determinación de los heteroátomos detectables por ICP presentes de forma natural en las proteínas (como puede ser el caso del P en las fosfoproteínas) permite su cuantificación absoluta a niveles traza. Por ello, en los últimos años, los procedimientos de marcaje con heteroátomos (labelling) se han convertido en herramientas muy importantes como estrategias para la cuantificación absoluta de cualquier proteína con el ICPMS. Como consecuencia de lo expuesto, el objetivo general de la presente Tesis Doctoral fue: El desarrollo de metodologías analíticas, basadas en el empleo de técnicas de Espectrometría de Masas Elemental y Molecular, que permitan la determinación absoluta, exacta y precisa de péptidos y fosfopéptidos. Así, en el primer capítulo se llevó a cabo el desarrollo de un método exacto y preciso para la cuantificación absoluta de fosfopéptidos mediante capHPLC acoplado a un ICPMS y empleando como patrón de cuantificación un estándar comercial de P. El desarrollo instrumental propuesto se aplicó a la cuantificación de los diferentes fosfopéptidos trípticos presentes en muestras de caseína, que fueron identificados inequívocamente con el análisis en paralelo por capHPLC-ESI-TOFMS. En el segundo capítulo se aplicó la estrategia desarrollada para la evaluación de procesos de enriquecimiento de fosfopéptidos con cartuchos de TiO2. Los resultados obtenidos se compararon con el análisis en paralelo con MALDI-TOFMS. A continuación, en el tercer capítulo se empleó la elevada precisión de la metodología desarrollada para hacer posible la realización de los estudios cinéticos de fosforilación/defosforilación más detallados publicados hasta la fecha. En el cuarto capítulo, se llevó a cabo la optimización de una estrategia innovadora de enriquecimiento de fosfopéptidos con una columna multimodo y detección en línea por ESIMS. La optimización se llevó a cabo con péptidos sintéticos y a continuación se evaluó la eficacia del enriquecimiento en un digerido tríptico de caseína. Por último se aplicó al estudio de mezclas de proteína no fosforilada con trazas de proteína fosforilada. Finalmente, en la última parte de la Tesis se desarrolló una estrategia específica y cuantitativa de marcaje directo de péptidos con iodo para hacerlos detectables por ICPMS (labelling). La metodología desarrollada se validó con la cuantificación de un Material de Referencia del Instituto Nacional de Patrones y Tecnología de los EEUU (NIST), constituído por tres péptidos certificados. Además se evaluó su potencial para la cuantificación absoluta y exacta de proteínas mediante el análisis del digerido tríptico de la ß-caseína.