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Requerimientos estructurales de la hexoquinasa2 para la señalización por glucosa en Saccharomyces cerevisiae

Author:
Peláez Cristóbal, RafaelUniovi authority
Director:
Moreno Sanz, Fernando EugenioUniovi authority; Herrero Espílez, Emérita PilarUniovi authority
Centro/Departamento/Otros:
Bioquímica y Biología Molecular, Departamento deUniovi authority
Publication date:
2009-12-11
Abstract:

La Hxk2 de S.cerevisiae es una moonlighting protein o proteína de doble vida. En el citoplasma es la principal responsable de la fosforilación de la glucosa en el carbono 6, mientras que en el núcleo participa en la represión de genes implicados en la utilización de otras fuentes de carbono alternativas. La relación entre estas dos funciones, y los dominios implicados en ellas, no han sido determinados hasta la fecha. En la presente tesis hemos analizado cuales son los dominios de la Hxk2 implicados en cada función y determinado los dominios implicados en la interacción con las proteínas del complejo represor como Mig1, y las del complejo Snf1, Snf1, Snf4 y Gal83. Siguiendo esta misma línea de trabajo hemos desarrollado dos mutantes estables que presentan disociadas las dos funciones de la Hxk2: uno carente de actividad catalítica que mantiene la función reguladora y otro con actividad catalítica que ha perdido su función reguladora de la expresión génica. De esta manera se confirma la hipótesis de que ambas funciones son independientes una de la otra y que se pueden asociar a dominios diferentes de la proteína. El hecho de que la función reguladora de la Hxk2 se realice a nivel nuclear exige la existencia de mecanismos que posibiliten la entrada y salida del núcleo de la proteína. Por tanto, nos propusimos estudiar el tráfico núcleo-citoplasmático de la Hxk2. En este trabajo hemos caracterizado los mecanismos de exportación e importación nuclear de la proteína Hxk2 demostrando que es sustrato de la importina Kap95 (importina-ß) para entrar en el núcleo, mientras que utiliza la exportina Xpo1 (homólogo de Crm1 de humanos) para su salida al citoplasma. Además hemos localizado y caracterizado dos secuencias de exportación nuclear (NES) en la Hxk2 que son vitales para la interacción con Xpo1, lo que representa un nuevo dominio estructural de la Hxk2, no descrito hasta el momento. Hemos podido establecer que el mecanismo de exportación de Hxk2 está modulado por la proteína Gsp1 (Ran) en función de su estado de activación con GTP o GDP, de tal manera que se forma un trímero Xpo1-Hxk2-Gsp1-GTP que se desorganiza y separa cuando el GTP se hidroliza a GDP. Finalmente, hemos demostrado que la fosforilación en la Serina 14 de la Hxk2 regula los mecanismos de exportación de Hxk2 en función de la glucosa del medio, lo que supone un punto de integración y conexión entre los mecanismos de tráfico núcleo-citoplásmico con los procesos de represión por glucosa.

La Hxk2 de S.cerevisiae es una moonlighting protein o proteína de doble vida. En el citoplasma es la principal responsable de la fosforilación de la glucosa en el carbono 6, mientras que en el núcleo participa en la represión de genes implicados en la utilización de otras fuentes de carbono alternativas. La relación entre estas dos funciones, y los dominios implicados en ellas, no han sido determinados hasta la fecha. En la presente tesis hemos analizado cuales son los dominios de la Hxk2 implicados en cada función y determinado los dominios implicados en la interacción con las proteínas del complejo represor como Mig1, y las del complejo Snf1, Snf1, Snf4 y Gal83. Siguiendo esta misma línea de trabajo hemos desarrollado dos mutantes estables que presentan disociadas las dos funciones de la Hxk2: uno carente de actividad catalítica que mantiene la función reguladora y otro con actividad catalítica que ha perdido su función reguladora de la expresión génica. De esta manera se confirma la hipótesis de que ambas funciones son independientes una de la otra y que se pueden asociar a dominios diferentes de la proteína. El hecho de que la función reguladora de la Hxk2 se realice a nivel nuclear exige la existencia de mecanismos que posibiliten la entrada y salida del núcleo de la proteína. Por tanto, nos propusimos estudiar el tráfico núcleo-citoplasmático de la Hxk2. En este trabajo hemos caracterizado los mecanismos de exportación e importación nuclear de la proteína Hxk2 demostrando que es sustrato de la importina Kap95 (importina-ß) para entrar en el núcleo, mientras que utiliza la exportina Xpo1 (homólogo de Crm1 de humanos) para su salida al citoplasma. Además hemos localizado y caracterizado dos secuencias de exportación nuclear (NES) en la Hxk2 que son vitales para la interacción con Xpo1, lo que representa un nuevo dominio estructural de la Hxk2, no descrito hasta el momento. Hemos podido establecer que el mecanismo de exportación de Hxk2 está modulado por la proteína Gsp1 (Ran) en función de su estado de activación con GTP o GDP, de tal manera que se forma un trímero Xpo1-Hxk2-Gsp1-GTP que se desorganiza y separa cuando el GTP se hidroliza a GDP. Finalmente, hemos demostrado que la fosforilación en la Serina 14 de la Hxk2 regula los mecanismos de exportación de Hxk2 en función de la glucosa del medio, lo que supone un punto de integración y conexión entre los mecanismos de tráfico núcleo-citoplásmico con los procesos de represión por glucosa.

URI:
http://hdl.handle.net/10651/14953
Other identifiers:
https://www.educacion.gob.es/teseo/mostrarRef.do?ref=850995
Local Notes:

Tesis 2009-104

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