Sensores electroquímicos de ADN para la detección de Legionella pneumophila

Abstract

En este trabajo, se ha desarrollado un genosensor electroquímico de hibridación con formato sándwich y amplificación enzimática para secuencias especificas de Legionella pneumophila, en el que se emplea como sonda de captura una secuencia de ADN con forma de horquilla. Se ha demostrado que el empleo de este tipo de secuencias sonda da lugar a mejoras de sensibilidad y, especialmente, de selectividad en comparación con las clásicas sondas lineales. El genosensor que mejores prestaciones analíticas ofrece se obtiene por quimisorción sobre electrodos de oro de monocapas binarias oligonucleótido estructurado tiolado en el extremo 5¿mercaptohexanol. En el ensayo sándwich se emplea como secuencia de ácido nucleico informadora un oligonucleótido modificado con el enzima fosfatasa alcalina a través del enlace biotina-estreptavidina. Con este esquema de diseño y un formato de detección voltamperométrica se obtienen excelentes características de detectabilidad, con un límite de detección de 340 pM y un rango lineal hasta 2 µM. El sensor presenta además extraordinaria selectividad, ya que permite discriminar entre secuencias especificas de L. pneumophila y L. longbeachae o L. micdadei sin necesidad de establecer condiciones drásticas de trabajo. El ensayo optimizado ha sido adaptado a un dispositivo desechable utilizando electrodos serigrafiados. Asimismo, este esquema de detección ha sido integrado en un sistema microfluídico con detección electroquímica, reduciendo considerablemente el tiempo de análisis y el consumo de reactivos. El genosensor electroquímico se ha aplicado a la detección y cuantificación de Legionella pneumophila en muestras de agua contaminada, utilizando una etapa previa de amplificación mediante PCR. Este ensayo permite detectar L. pneumophila de manera simple y rápida en muestras que contienen solamente 10e2 copias del genoma de la bacteria y distinguir entre éstas y 10e3 o 10e4 copias del patógeno, valores límite que se recogen en la legislación ambiental vigente para determinar el tipo de acciones correctivas en instalaciones con riesgo de proliferación de L. pneumophila.