Caracterización molecular de un nuevo calicivirus de conejo

Abstract

En este trabajo de experimentación se muestran los resultados obtenidos en la caracterización de este nuevo aislado viral. El RaV es un virus que puede proliferar eficazmente en el laboratorio en diferentes cultivos celulares, en especial en las líneas HEK 293T, HeLa y Vero. La línea celular Vero es la más permisiva y se obtienen altos títulos virales en poco tiempo. Los viriones purificados de cultivos infectados presentan una estructura a microscopía electrónica similar a la que presentan los virus de la familia Caliciviridae y la cápsida de estos viriones presenta el componente mayoritario de este tipo de virus, la VP1. La cápsida viral encierra los dos RNAs típicos de los calicivirus, el RNA genómico y el RNA subgenómico, coterminal en el extremo 3' con el RNA genómico. El RNA genómico viral ha sido clonado y se ha determinado su secuencia de nucleótidos. Así se ha podido constatar que su genoma está organizado en tres pautas abiertas de lectura flanqueadas por dos regiones cortas no codificantes en ambos extremos. El extremo 3' contiene una cola de poli(A). La primera de las tres pautas codifica una poliproteína que presenta algunas secuencias aminoacídicas conservadas en esta familia de virus. Se ha demostrado en cultivos infectados que esta proteína sufre un procesamiento en diferentes enlaces peptídicos, detectándose pronto en la infección diferentes proteínas maduras del RaV de unos 26, 32, 39, 30, 13 y 76 kDa, posicionadas en la poliproteína en el mismo orden desde su extremo amino, y algún precursor de algunas de estas proteínas. La proteína de 13 kDa es la VPg y está también presente en los viriones, unida a los dos RNAs del RaV. La proteína de 76 kDa presenta los dominios conservados proteasa y polimerasa. Se ha demostrado la actividad RNA polimerasa de esta proteína in vitro, y su actividad proteasa en el sistema heterólogo E. coli. La segunda pauta de lectura codifica para un precursor de la VP1, al igual que ocurre con miembros del género Vesivirus. En las células de cultivo infectadas se ha identificado el producto principal de su procesamiento, la proteína mayoritaria de la cápsida. Por su parte, la ORF3 codifica para una proteína de pequeño tamaño, cuya función es aún desconocida en los calicivirus. La comparación de la secuencia de la poliproteína del RaV con las de otros calicivirus mostró un alto grado de similitud con los vesivirus de origen marino, por lo que se ha clasificado este nuevo aislado viral dentro del género Vesivirus. La infección de este calicivirus se inhibe en cultivos celulares empleando diferentes compuestos orgánicos. Los PMO, análogos a cadenas sencillas de DNA de corto tamaño, son uno de ellos. Dos PMOs, uno dirigido contra una región presente en el genoma y otro dirigido contra otra región localizada en el RNA subgenómico y en el genoma, son muy efectivos bloqueando la proliferación del RaV. Las regiones dianas de estos dos agentes antivirales presentan los AUG iniciadores de la traducción del genoma y el RNA subgenómico del RaV. Debido a la situación de la diana de los PMOs y a resultados de ensayos de traducción in vitro de RNAs sintéticos similares al RNA genómico o subgenómico, ambos PMOs actuarían bloqueando la traducción de los RNAs virales.