Desarrollo mediante cultivo in vitro de osteoblastos mandibulares humanos sobre matriz proteica tridimensional. Análisis del comportamiento in vivo en animales inmunoincompetentes

Abstract

OBJETIVOS: La ingeniería tisular es una prometedora estrategia para la reconstrucción ósea, especialmente en el campo de la cirugía oral y maxilofacial. El presente trabajo trata de investigar la posibilidad de desarrollar hueso in vitro a partir de osteoblastos de origen humano, capaces de retener su perfil osteoblástico y su capacidad de mineralización cuando son sembrados sobre una matriz proteica tridimensional desarrollada a partir de plasma humano. Se realizó para ello un estudio histológico e inmunohistoquímico de las muestras in vitro. Por otra parte, se realizó una evaluación clínica e histológica del injerto implantado de forma subcutánea en el dorso de ratones atímicos, así como del injerto implantado en defectos críticos mandibulares creados en ratas inmunocomprometidas. MATERIAL Y MÉTODO: Las pequeñas muestras de hueso corticoesponjoso se obtuvieron durante cirugía oral rutinaria, sin morbilidad añadida para el paciente. Los osteoblastos fueron cultivados y sembrados en un soporte proteico tridimensional obtenido a partir de plasma humano cruzado con glutaraldehído. A los 30 días, se realizó un estudio histológico e inmunohistoquímico, así como de microscopía electrónica de barrido (MEB) y microanálisis de las muestras obtenidas. Estas cultivos sobre matriz tridimensional fueron injertados en el dorso de ratones atímicos, donde se mantuvieron 75 y 150 días. Por último, se realizó el injerto de los mismos en defectos críticos de 5 mm. creados artificialmente en mandíbulas de ratas atímicas, sirviendo el lado contralateral (defecto sin injerto) como control. A las 5, 8 y 11 semanas se evaluaron los resultados mediante tomografía computarizada y procesamiento digital de las imágenes obtenidas. En todos los casos, tanto in vitro como en ratones como en defectos mandibulares de ratas, todos los cultivos fueron realizados por duplicado, con suero humano y suero bovino, y los resultados entre ambos fueron comparados. RESULTADOS: Los osteoblastos cultivados mantuvieron el perfil osteoblástico y expresaron fosfatasa alcalina tras 30 días sembrados en la matriz. La tinción de hematoxilina-eosina puso de manifiesto la presencia de células osteoblásticas y matriz extracelular, y la tinción de von Kossa pudo confirmar la mineralización de la misma. El crecimiento y proliferación celular fue demostrado también mediante MEB tras 30 días en los soportes. Las células formaron agrupados con numerosas conexiones intercelulares. La superficie mayoritaria del soporte estaba cubierto por osteoblastos transcurrido el citado periodo. El microanálisis digital de las imágenes de MEB demostró la presencia de calcio y fósforo, mientras que ambos iones estaban totalmente ausentes en la muestra control (scaffold sin células). El análisis histológico de los implantes subcutáneos en el dorso de los ratones inmunoincompetentes reveló la neoformación ósea progresiva a los 75 y 150 días, y los osteoblastos expresaron osteocalcina y vimentina humanas. Por otra parte, las ratas atímicas fueron sacrificadas a las 5, 8 y 11 semanas, y las hemimandíbulas fueron examinadas radiográfica e histológicamente. La formación progresiva de hueso en la región del defecto fue contratada por ambos métodos, mientras que en el lado control se encontró una ausencia total de neoformación ósea. El procesamiento digital de las imágenes de tomografía computarizada confirmó este hecho. En ninguno de los estudios se encontró una diferencia significativa entre los cultivos realizados con suero bovino o con suero humano. CONCLUSIONES: Los osteoblastos mandibulares humanos son células capaces de proliferar y mantener su capacidad osteoformadora tanto in vitro como in vivo. El scaffold desarrollado resulta un sustrato adecuado para ello, y podría tratarse de una valiosa herramienta para la ingeniería ósea tisular en cirugía oral y maxilofacial.