Bases fisiológicas y moleculares en la micropropagación de familias de Pinus pinea L.

Abstract

La micropropagación de familias de Pinus pinea L. mediante organogénesis adventicia es una herramienta biotecnológica que permite la obtención de individuos clonales así como establecer un sistema experimental adecuado para el estudio de las bases fisiológicas del proceso caulogénico. El objetivo de la Tesis Doctoral ha sido la optimización del protocolo de micropropagación de 6 familias seleccionadas, evaluando su respuesta organogénica y certificando la estabilidad genética de los individuos obtenidos mediante distintos marcadores moleculares (RAPD, AFLP, ISSR y SAMPL), resultados que también apoyan la baja variabilidad genética descrita para esta especie. Además, ensayos de transferencia de medios e histológicos han permitido establecer etapas discretas durante el periodo de inducción caulogénica. Complementando estos resultados, análisis hormonales tanto de absorción y metabolismo del agente inductor (la citoquinina benciladenina) como de niveles endógenos de citoquininas tanto aromáticas como isoprenoídicas han permitido definir las dinámicas asociadas a la inducción de yemas en cotiledones maduros de P. pinea, confirmando como naturales, por primera vez en coníferas, las citoquininas aromáticas benciladenina, ribósido de benciladenina y para-Topolina. Tras seleccionar las familias que presentaban una mayor y menor intensidad de respuesta caulogénica, se ha podido asociar una mayor absorción de la benciladenina aplicada exógenamente al medio de cultivo con una mayor respuesta caulogénica. También en las primeras etapas de cultivo existe una relación entre mayor magnitud de respuesta caulogénica y mayores niveles endógenos de benciladenina, ribósido de benciladenina y meta-Topolina, mientras que la menor intensidad de respuesta caulogénica se asocia con mayores niveles endógenos de ribótidos y glucósidos aromáticos. The micropropagation of Pinus pinea L. families by adventitious organogenesis is a suitable biotechnological tool for not only obtaining clonal individuals but also for setting an experimental system for going depth into the physiological bases of the caulogenic process. The main objective of the Doctoral Thesis has been the optimization of a micropropagation procedure for 6 selected half-sibling families. It has also been evaluated their organogenic response, certifying the genetic stability by using different molecular markers (RAPD, AFLP, ISSR and SAMPL), these results also support the low genetic variability proposed to this species. Additionally, media transfer assays and histological approaches have allowed us the establishment of several discrete phases during the caulogenic induction. Furthermore, hormonal analyses of absorption and metabolism of the inductor agent (the cytokinin benzyladenine) and other natural occurring cytokinins, both aromatic and isoprenoidic type, have defined the dynamics associated with the bud induction on mature cotyledons of P. pinea. For the first time in conifers, the aromatic cytokinins benzyladenine, benzyladenine riboside, and para-Topolin are confirmed as naturally occurring cytokinins. After selecting those families with extremely intensity of response, it has been matched that more uptake of exogenously applied benzyladenine leads to more caulogenic response intensity. During the first hours of induction culture, there is a relationship between a high magnitude of response and higher levels of benzyladenine, benzyladenine riboside and meta-Topolin. On the contrary, a lower response intensity is associated with higher levels of ribotides and aromatic glucosides.