Desarrollo y aplicación de sistemas vector/hospedador en bifidobacterias

Abstract

72 aislados de diferentes especies de bifidobacterias fueron analizadas en busca de plásmidos, se encontraron seis perfiles plasmídicos distintos, dos de ellos con un único plásmido y cuatro que contienen al menos dos. El plásmidos aislado de la cepa B. catenulatum L48 (pBC1) fue seleccionado para su posterior caracterización. El plásmido se reveló como una molécula circular de 2540 pares de bases con un contenido G+C del 64%. En el hipotético origen de replicación se identificó una repetición de 24 nucleótidos repetida tres veces y media además de cinco repeticiones invertidas, que recuerdan la organización de plásmidos theta replicativos. El análisis de la secuencia también reveló la presencia de tres ORFs que codifican para péptidos mayores de 50 aminoácidos: repB, que codifica para la replicasa, un gen transcripcionalmente acoplado (orfX-like), y copG-like. Con el fin de estudiar las relaciones con pBC1, se realizó un árbol filogenético en el que la proteína RepB de pBC1 quedó agrupada junto con las proteínas de replicación de los plásmidos pMB1 y pDOJH10S, ambos procedentes de B. longum, pero también con las proteínas Rep de los plásmidos ColE2 y pXZ10142) aislados de E. coli y Corynebacterium glutamicum, respectivamente, y en los que la replicación tipo theta se ha demostrado experimentalmente. Experimentos de hibridación mostraron que el replicón de pBC1 no es común entre las bifidobacterias. Con el objeto de determinar el replicón mínimo de pBC1 así como la funcionalidad de las distintas ORFs, diferentes fragmentos de pBC1 se amplificaron mediante PCR y se clonaron en el vector pBif, que por si sólo no es capaz de replicar en bifidobacterias. Los fragmentos generados van desde el que engloba prácticamente toda la secuencia de pBC1 hasta el menor de todos que solamente incluye el gen repB y sus secuencias inmediatamente anteriores. Todos los derivados se mostraron capaces de replicar en bifidobacterias.