Identificación y regulación del gen estructural de la aminopeptidasa I de Saccharomyces cerevisiae

Abstract

En este trabajo se ha procedido a identificar y caracterizar al gen estructural de la aminopeptidasa yscI, con el fin de estudiar los mecanismos de regulación a que está sujeta su expresión y poder establecer junto con los datos descritos acerca del resto de las proteasas vacuolares, si responde a un patrón general de regulación o bien presenta características diferenciales. El aislamiento del gen se llevó a cabo por complementación de una cepa mutante al transformarla con una genoteca de S. cerevisiae, identificando los clones positivos mediante un ensayo de actividad en placa que usa como sustrato al dipéptido bloqueado Leu-Gly-NH2. Tras el análisis de los plásmidos recombinantes se identificó un fragmento BgIII-SphI de 3.5 kb que contenía al gen APE1, cuya integración permitió comprobar que aparecía en una sola copia en el genoma de la levadura. Su secuenciación mostró que su región codificadora corresponde a 1542 nucleótidos lo que supone un polipéptido de 514 aminoácidos y 57003 Da. Estos datos indican que este enzima se sintetiza en forma zimogénica que ha de ser procesada post-traduccionalmente. A diferencia del resto de las proteasas vacuolares, carece del péptido señal hidrofóbico necesario para internalizarse en el retículo endoplásmico e iniciar su ruta de transporte hacia la vacuola. Por otra parte, su extremo aminoterminal parece adoptar una estructura en hélice alfa propia de proteínas mitocondriales que se sintetizan en ribosomas libres. El ARN mensajero posee un tamaño de 1.75 kb. La expresión del gen APE1 está sometida a control transcripcional ejercido por la concentración de glucosa existente en el medio de cultivo. Y, del mismo modo, existe un segundo punto de regulación a nivel post-transcripcional, probablemente realizado por la proteinasa yscA encargada de la maduración de la forma zimogénica de la aminopeptidasa yscI.