Identificación de elementos reguladores en CIS de la expresión del gen HXK2 de Saccharomyces cerevisiae

Abstract

El objetivo de la presente tesis consistió en estudiar secuencias reguladoras dentro de la secuencia codificadora del gen HXK2 y de su promotor. Se localizaron e identificaron secuencias reguladoras a partir de los resultados obtenidos por Martínez (1994) que obtuvo fusiones en plasmidos Ylp356 diversos fragmentos del promotor y gen estructural. La expresión de la beta galactosidasa en los genes de fusión mostró que solamente la fusión que tiene 404 pb. De la secuencia codificadora presenta actividad en glucosa y niveles basales en etanol, es decir la síntesis de la proteína responde a la misma regulación que la hexoquinasa 2 (Herrero y col., 1995). La expresion en aquellas construcciones que llevan 39 pb. De la secuencia codificadora incluidas en la fusión, es mucho mayor en etanol que en glucosa. Estos resultados sugirieron que era necesaria la existencia de secuencias reguladoras posteriores para que tenga lugar la transcripción correcta del gen. El estudio del fragmento +40 +404 de la secuencia codificadora de HXK2 se inició subclonándolo en el vector multicopia pUC19. una vez ampliado el fragmento y marcado con (alfa 32P) dCTP se realizaron experimentos de movilidad electroforética. Para localizar e identificar el o los sitios de unión de proteínas reguladoras en este fragmento se realizaron deleciones de 5' a 3' empleando exonucleasa III. Para estudiar las deleciones obtenidas se construyó el vector pNI9 a partir del pNG22 que contiene el gen de la beta glactosidasa bajo el control del promotor CYC1. La expresión de beta galactosidasa de las cepas transformadas con las deleciones en condiciones de derepresión demostró que existen 2 elementos dentro de la región codificadora del gen HXK2. Se acotó el primero de ellos entre +136 y +193, y el segundo entre +220 y +263. Para identificar los sitios de unión de estas proteínas se realizaron ensayos de "footprinting" in vitro, los resultados de éstos identificaron 2 elementos (…)