Nuevas estrategias analíticas para el estudio de ferroproteínas usadas en el diagnóstico clínico mediante Espectrometría de Masas

Abstract

La glicosilación y la glicación de proteínas son modificaciones post-trasducionales que afectan a un gran número de proteínas extracelulares y de la superficie celular. Dichas modificaciones implican cambios o alteraciones en el nivel de oligosacáridos asociados a la cadena de aminoácidos de las proteínas y lo más interesante es que pueden ser empleados como biomarcadores de ciertas patologías clínicas. En la presente Tesis Doctoral se abordarán estas modificaciones post-trasducionales en proteínas que contienen hierro (Fe) en su estructura como son la transferrina sérica y la hemoglobina. Estas ferroproteínas están involucradas en numerosos procesos biológicos, como la síntesis de ADN, la transferencia electrónica, procesos de detoxificación, etc y además, sus glico-conjugados pueden ser empleados como biomarcadores como alcoholismo crónico ó desórdenes congénitos de glicosilación (CDGs) en el caso de la transferrina, y diabetes en el caso de la hemoglobina. Por tanto, dada su gran importancia biológica y clínica, y la falta de métodos de análisis específicos para estas especies, existe un gran interés en el desarrollo de estrategias analíticas para llevar a cabo estudios clínicos sobre estas proteínas que permitan sus análisis no solo estructural sino cuantitativo (absoluto). En este sentido, en la presente Tesis Doctoral se han desarrollado nuevos métodos (exactos, precisos y absolutos) para la estandarización de los ensayos rutinarios utilizados en el diagnóstico de patologías clínicas. En consecuencia, nos pareció de interés establecer como objetivo general de la presente Tesis Doctoral:La puesta a punto de metodologías analíticas para el estudio cualitativo y cuantitativo de ferroproteínas utilizados como biomarcadores de patologías clínicas mediante la combinación de técnicas de MS, elemental y molecular. Así, en la primera parte del trabajo (Capítulo 1) se han puesto a punto métodos de análisis de proteínas intactas por Espectrometría de Masas estructural comparando la instrumentación de MALDI-TOF con la de Electrospray-Q-TOF. Además, la metodología híbrida HPLC-ICP-MS aplicada a un ejemplo clásico de especiación de Fe se ha adaptado a la separación de las sialoformas de la transferrina de suero humano demostrando una elevada eficacia y sensibilidad para la detección de estas especies, importantes biomarcadores de alcoholismo crónico. La metodología es además eficaz para la evaluación cualitativa de las diferencias entre individuos control y pacientes alcohólicos. Finalmente, la creación de un modelo matemático basado en el análisis Diofántico ha resultado ser una herramienta complementaria a la técnica de ESI-Q-TOF para establecer una base de datos ajustada a las necesidades de interpretación de los espectros de masas de los diferentes glicoconjugados de la transferrina tanto de suero humano como de líquido cefalorraquídeo. En el segundo capítulo se han abordado los aspectos cuantitativos del problema anterior desarrollando y aplicando, por primera vez, un método de análisis por dilución isotópica especiada de una metaloproteína, la transferrina de suero humano, y se han podido obtener concentraciones individuales de las distintas sialoformas de esta especie. La metodología se ha validado a través del análisis de un material de referencia certificado con excelentes resultados cuantitativos. A continuación, y mediante el empleo de estrategias de saturación de la transferrina sérica con hierro natural y hierro isotópicamente enriquecido ha sido posible obtener la cuantificación directa de parámetros de interés clínico como son el TIBC, el porcentaje de saturación de la transferrina, cantidad total de Fe sérico y el UIBC. Todos estos parámetros, que de forma rutinaria se obtienen mediante ensayos independientes pueden ser obtenidos con solo dos medidas analíticas. La validación de las metodologías de análisis se ha llevado a cabo satisfactoriamente a través del uso de materiales de referencia certificados, del empleo de metodologías alternativas y de la comparación con otros laboratorios gracias a la colaboración del Hospital Central de Asturias. Finalmente, en la última parte de la Tesis se aborda satisfactoriamente la determinación de la glicohemoglobina (GHb) en glóbulos rojos a través de la medida del Fe presente en el grupo hemo a través de estrategias de especiación empleando la cromatografía de cambio catiónico como método de separación y la dilución isotópica de Fe vía ICP-MS como sistema de detección. La estrategia proporciona buenos resultados en materiales de referencia y permite discriminar los pacientes diabéticos respecto a los individuos control.