Caracterización de la composición proteica de microvesículas circulantes

Abstract

Las microvesículas son pequeñas estructuras liberadas por las células al medio extracelular en respuesta a mediadores inflamatorios, activación celular y apoptosis. Estas vesículas son de gran interés debido a su posible papel como biomarcadores en diversas patologías. Estudios previos demuestran que las MVs se encuentran incrementadas en sangre en pacientes con esclerosis múltiple y que pueden contribuir a la progresión de la enfermedad. Para determinar los posibles mecanismos responsables de dicho efecto es necesario conocer su composición. En base a esto, el objetivo de este trabajo es optimizar un método de aislamiento y realizar la caracterización proteica de las MVs de pacientes con esclerosis múltiple mediante técnicas proteómicas. Se han comparado dos protocolos de aislamiento, la ultracentrifugación y un kit comercial de precipitación de exosomas con el fin de esclarecer cuál resulta más eficaz. Además, se ha llevado a cabo un estudio de la integridad, diámetro y concentración de las vesículas aisladas por ambos métodos mediante microscopía electrónica, DLS y Nanosight. Se ha observado que el kit comercial resulta más eficiente en cuanto al número de vesículas precipitadas por volumen inicial de muestra que el método de ultracentrifugación. El uso de este método implica una precipitación ácida de proteínas previa a la electroforesis, no descrita en el protocolo comercial. Además el proceso de digestión de la proteinasa K resulta insuficiente para eliminar la contaminación de proteínas solubles, a pesar de haber incrementado su tiempo de incubación. En conclusión, para llevar a cabo un estudio proteómico, el método de aislamiento más efectivo en cuanto a pureza de la muestra, sería una ultracentrifugación. Dado que el kit comercial es más eficiente en cuanto a número de vesículas aisladas sería conveniente combinar este método con métodos adicionales de purificación con el fin de obtener una muestra óptima para el estudio proteómico.