Síntesis, caracterización y bioconjugación de Nanoclústeres de plata para su aplicación a la determinación de Metalotioneína III en tejidos biológicos por Fluorescencia

Abstract

El actual interés hacia los Nanomateriales viene precedido por el gran crecimiento y desarrollo que ha tenido en las últimas décadas la Nanociencia y Nanotecnología. Concretamente, los Nanoclústeres metálicos se presentan como uno de los nuevos tipos de nanomateriales con características particulares, que les otorgan fotoluminiscencia y que los convierten en una herramienta compatible con numerosas aplicaciones relacionadas con la biología. En concreto, muestran especial interés en su aplicación como sustitutos de fluoróforos orgánicos para el marcaje biológico en la detección de determinadas moléculas biológicas, mediante el empleo de inmunoensayos. Dentro de los Nanoclústeres, son de especial relevancia los Nanoclústeres de plata, ya que poseen una línea de investigación bastante activa, debido a sus propiedades ópticas y a su elevada biocompatibilidad. A su vez, existen estudios que demuestran la relación directa entre la sobreexpresión de determinadas moléculas biológicas con la aparición de ciertas enfermedades, como es el caso de la sobreexpresión de la proteína Metalotioneína III en tejidos cerebrales y su relación con la aparición de la enfermedad de Alzheimer. Por todo ello, se llevó a cabo un estudio para la síntesis, caracterización y bioconjugación de Nanoclústeres de plata para su posible aplicación en la detección de MT-III en tejidos biológicos por fluorescencia, mediante el uso de diferentes técnicas analíticas como la espectroscopía UV-VIS y de fluorescencia, espectrometría de masas (ICP-MS), y análisis mediante microscopía electrónica de transmisión (HR-TEM) y microscopía láser confocal. Los resultados obtenidos en este estudio muestran una síntesis con un elevado rendimiento (92.77 %) y una intensidad de fluorescencia muy elevada, mostrando por otro lado una estabilidad reducida con exposición a la luz de un máximo de 5.5 horas, y estabilidades mayores en el caso de su almacenamiento a oscuridad de hasta 15 días. Estos resultados fueron obtenidos al mantener los AgNCs en la disolución reguladora HEPES. Respecto a su análisis estructural, los AgNCs presentan un tamaño promedio de 2.69 ± 0.77 nm, con una distribución de tamaños bastante homogénea. Por otro lado, se determinó una concentración de AgNCs en disolución de 7.98·1014 NCs/mL, lo que nos permitió alcanzar una relación molar óptima Ab:AgNCs en el proceso de bioconjugación de 1:5, mediante la caracterización de la fluorescencia emitida y la funcionalidad del anticuerpo. Por último, se desarrolló un inmunoensayo competitivo para la detección de MT-III con el que fue posible un primer ensayo para la creación de una recta de calibrado que nos permita cuantificar MT-III en muestras o tejidos de concentración desconocida.