Generation of Atg4A deficient cells through the use of CRISPR/Cas9 technology and analysis of the consequences of Atg4A loss in autophagy pathway

Abstract

La autofagia constituye un importante mecanismo de protección que permite a las células sobrevivir en respuesta a múltiples factores estresantes. Dentro de los genes implicados en la autofagia, conocidos como genes Atg, el sistema proteolítico Atg4-Atg8 presenta un especial interés. En organismos simples, como levaduras, este sistema está compuesto únicamente por un sustrato (Atg8) y una proteasa (Atg4). Sin embargo, en mamíferos se conocen 4 ortólogos de Atg4 (Atg4A, Atg4B, Atg4C y Atg4D) y 6 ortólogos de Atg8 (LC3A-C y GABARAP, GABARAP-L1 o ATG8L y GABARAP-L2 o GATE-16) en contraposición a otros genes esenciales en autofagia como Atg3, Atg5 y Atg7 los cuales solo presentan un ortólogo. Hoy en día, se han generado modelos celulares o animales deficientes en Atg4B, Atg4C y Atg4D, lo cual deja Atg4A como una incógnita. En este trabajo se ha intentado obtener células Knock-out para Atg4A mediante la técnica CRISPR-Cas9, utilizando bien transfección convencional o infección lentiviral. Desafortunadamente, no se ha conseguido establecer una línea celular deficiente en Atg4A con ninguno de estos métodos. Paralelamente, se ha caracterizado el estado de los posibles sustratos de Atg4A en células en las que se había deleccionado previamente los genes que codifican para Atg4B, Atg4C y Atg4D, dejando Atg4A como única proteasa Atg4 funcional. Para esto, se han empleado técnicas de inmunofluorescencia y análisis Western Blot, bien de proteínas endógenas o sobreexpresadas mediante transfección. Mediante el uso de estas técnicas, se ha demostrado que estas células presentan menor flujo autofágico en comparación con las células Wild-type, debido a que Atg4A es capaz de activar proteolíticamente únicamente ATG8L y GATE-16, en ausencia de sus parálogos. En conclusión, en este trabajo exponemos diferentes técnicas tanto para establecer células Knock-out para Atg4A como para la caracterización de la especificidad de Atg4A frente a los distintos ortólogos murinos de Atg8 en ausencia de las otras proteasas de la familia Atg4.