Reconocimiento Molecular Mediante Aptámeros de Péptidos Inmunotóxicos de Gluten

Abstract

La enfermedad celiaca es una enfermedad que está a la orden del día, ya que afecta a un 1% de la población mundial. Esta enfermedad consiste en un daño que se produce en las microvellosidades del intestino delgado como consecuencia de la ingesta de gluten. Por tanto, debemos saber qué es el gluten. El gluten se define como aquella fracción proteica de un cereal (ya sea trigo, cebada, centeno o avena, y de sus variedades híbridas) que es insoluble en agua y cloruro-sódico 0,5 M. Las proteínas que lo componen se clasifican según el fraccionamiento de Osbourne en gluteninas y prolaminas. Se creía que solamente las prolaminas eran inmunotóxicas y que, por tanto, eran las únicas causantes de esta enfermedad, pero recientemente se ha descubierto que también las gluteninas lo son. Además, se sabe que el péptido inmunodominante, es decir, el indicador primario de la enfermedad celiaca, es el péptido 33-mer, que se encuentra en la alfa-gliadina del trigo. Existe una normativa europea del año 2009 que fija las cantidades límite de gluten que pueden presentar los alimentos etiquetados como “sin gluten” (20 ppm) y “bajos en gluten” (100 ppm). Estos niveles no son lo suficientemente bajos para cubrir a todos los pacientes, pero la metodología analítica existente, ofrece límites de cuantificación cercanos a estos valores, por lo que no pueden disminuirse. Por eso, en este trabajo, se pretende desarrollar un aptasensor que permita determinar la fracción inmunotóxica del gluten, siendo el primer paso para diseñar un sensor electroquímico que permita determinar gluten en alimentos en menores cantidades que los métodos que se utilizan hasta ahora. Hoy en día, los métodos más utilizados son métodos inmunoquímicos. De hecho, el método considerado como oficial, se basa en el uso de un ensayo inmunoquímico ELISA tipo sándwich, en el que se utiliza un anticuerpo frente a una secuencia concreta de una determinada proteína. Pero como alternativa, en este trabajo, se propone el uso de aptámeros frente a los anticuerpos tradicionales, por presentar características más ventajosas. Los aptámeros son secuencias de nucleótidos de ADN o ARN que adoptan una estructura tridimensional característica capaz de reconocer con elevada selectividad y afinidad a una amplia gama de moléculas diana. El aptámero Gli1 utilizado en este trabajo, se obtuvo mediante un proceso in vitro que se denomina SELEX (Systematic Evolution Ligands by Exponential enrichment) que fue realizado en el Equipo de Electroanálisis de la Universidad de Oviedo para obtener aptámeros contra el péptido 33-mer. El objetivo fundamental de este trabajo de investigación se basa en el estudio de la interacción entre el aptámero Gli1 y el péptido 33-mer, como base para desarrollar un aptasensor electroquímico que permita llevar a cabo la determinación de la fracción inmunotóxica del gluten. Un sensor electroquímico se define como un dispositivo de pequeño tamaño que, como resultado de una interacción química entre el analito en disolución y el sensor, transforma información química o bioquímica de tipo cualitativo o cuantitativo en una señal medible y útil analíticamente. Un aptasensor es un tipo concreto de sensor electroquímico, en el que se utilizan aptámeros como receptor molecular inmovilizado, en este caso, sobre un sustrato de oro. Como resultado, se obtuvo que este ensayo puede detectar 30 nM de péptido (0,15 ppm), lo que constituye el primer paso hacia el desarrollo de un ensayo competitivo para detectar gluten en muestras reales, ya que con el ensayo propuesto se determina péptido, no gluten.