Detección rápida de Mycobacterium tuberculosis mediante un genoensayo electroquímico

Abstract

Existe una demanda creciente de métodos de detección rápida y sensible de agentes patógenos desde áreas muy diversas, entre las que destacan el diagnóstico médico y la seguridad alimentaria. Como alternativa a los métodos clásicos de detección, basados en el cultivo y que en general son lentos y de baja sensibilidad, se imponen los métodos moleculares basados en la detección de secuencias específicas de ADN características de la especie patógena. Entre los métodos de detección molecular, el más conocido es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta es una metodología de amplificación enzimática de ácidos nucleicos que requiere el empleo de ciclos térmicos y separación por electroforesis en gel de los productos o detección fluorimétrica a tiempo real de los mismos. Sin embargo, su complejidad, junto con el elevado coste de los equipos necesarios, dificulta su implantación en los laboratorios y hace muy difícil su miniaturización para análisis in situ. Los genosensores electroquímicos constituyen una opción muy atractiva para competir en este campo con otras técnicas moleculares. A pesar de que estos han experimentado un notable avance en los últimos años, en la mayoría de los casos han sido evaluados en muestras de oligonucleótidos de cadena corta. Sin embargo, la solución del problema que se plantea exige la detección de un fragmento específico de ADN incluido en el genoma completo del patógeno y con unos requerimientos de sensibilidad extremos. Por esta razón, en muchos casos es necesario recurrir a la amplificación previa de la muestra por PCR, que se utiliza no solo como sistema de amplificación sino también para restringir el tamaño de la secuencia a detectar. En este trabajo, para responder a la demanda de ensayos sensibles para la detección molecular de patógenos, con un coste razonable y capacidad para la inclusión en sistemas integrados, proponemos el acoplamiento de un proceso de amplificación isotérmica dependiente de helicasa (HDA) a un ensayo genomagnético con detección electroquímica. La amplificación HDA destaca por su simplicidad ya que empleando esencialmente el mismo esquema de reacción que la PCR, utiliza una helicasa termoestable para lograr la separación de las hebras copiadas, en lugar de ciclos de temperatura. Este esquema ha sido utilizado en el desarrollo de un método de detección rápida de Mycobacterium tuberculosis. Mediante un proceso HDA asimétrico, se obtienen copias en forma de hebra simple del fragmento del genoma seleccionado. De esta forma, se consigue obtener en condiciones isotérmicas un elevado número de copias de la secuencia analito, que a continuación se atrapan sobre micropartículas magnéticas. Estas sirven como plataforma para un posterior proceso de hibridación con una secuencia indicadora, que hace posible la detección electroquímica final. La metodología desarrollada permite ofrecer en unas horas resultados sobre la presencia de Mycobacterium tuberculosis en muestras clínicas.