Un abordaje de la recontrucción auricular desde la ingeniería tisular

Abstract

lntroducción: La reconstrucción de defectos auriculares, ya sean congénitos o adquiridos, supone un reto para la cirugía reconstructiva. Los métodos disponibles actualmente se resumen en reconstrucciones mediante cartílago autólogo, materiales sintéticos o prótesis externas. De ellos, Ia reconstrucción mediante cartílago costal constituye el gold standard actual.Sin embargo, no está exento de riesgos y complicaciones, entre los que están las extrusión del implante, la deformidad y el dolor residual de la zona donante, y la perforación pleural.Para superar las limitaciones de tejido donante (cartílago autólogo) y reducir la morbilidad asociada con su obtención, los métodos de ingeniería Tisular se postulan como una opción reconstructiva atractiva. Mediante este trabajo se pretende valorar la utilidad de un nuevo soporte desarrollado por el Centro Comunitario de Sangre y Tejidos a partir de proteínas plasmáticas en estrategias de ingeniería Tisular de cartílago para su posterior aplicación clínica en reconstrucción de defectos auriculares. Objetivos: 1. Medir las características estructurales y biocinéticas del soporte desarrollado a partir de proteínas plasmáticas. 2. Evaluar el comportamiento de cultivos de condrocitos auriculares sembrados sobre los soportes antes mencionados, con respecto a la capacidad de rediferenciación y producción de cartílago in vitro. 3. Evaluar el comportamiento de cultivos de condrocitos auriculares sembrados sobre soportes e implantados como injertos libres de forma heterotópica en el dorso de animales inmunodeficientes, con respecto a la capacidad de producción de cartílago. 4. Evaluar la capacidad del injerto antes mencionado utilizado de forma autóloga para reparar defectos auriculares. Material y métodos: El trabajo se organizó en cuatro subestudios: Subestudio l: Se produjeron soportes celulares a partir de sangre venosa de banco, mediante su desnaturalización por la adición de glutaraldehído y la posterior liofilización de la mezcla. Algunos soportes fueron analizados mediante microscopía electrónica de barrido para describir su microestructura. Otros fueron evaluados mediante un biorreómetro para medir su comportamiento ante la compresión. Por último, varios fueron implantados subcutáneamente en el dorso de un conejo de Nueva Zelanda. Posteriormente fueron extraídos periódicamente, pesados, fotografiados e incluidos para examen histológico para averiguar su velocidad de degradación. Subestudio ll:Se obtuvieron condrocitos a partir de biopsias de cartílago auricular de conejos de Nueva Zelanda. Estos condrocitos fueron expandidos en monocapa, sembrados sobre soportes proteicos y cultivados en medio condrogénico para su rediferenciación durante tres meses. Transcurrido esa tiempo, se tomaron muestras para examen histológico y mediante microscopía electrónica de barrido. Subestudio lll: Se sembraron cultivos de condrocitos rediferenciados sobre soportes celulares, y estos constructos se implantaron subcutáneamente en el dorso de un ratón atímico. Dos meses después, se sacrificó el animal y se extrajeron los implantes para su examen histológico. Subestudio lV: Se efectuaron defectos circulares de espesor completo en las orejas de 5 conejos de Nueva Zelanda. En algunos de esos defectos se introdujeron soportes sin células, en otros se introdujeron soportes sembrados con condrocitos autólogos expandidos y rediferenciados in vitro. Uno de esos cultivos se había marcado previamente con un retrovirus productor de Proteína Verde Fluorescente (GFP). Cuatro meses después, los animales fueron sacrificados y los sitios de implante fueron extraídos en bloque para su posterior estudio histológico e inmunohistoquímico. Resultados: Subestudio l. El análisis de las imágenes de microscopia electrónica de barrido mostraban una estructura espongiforme con un tamaño de poro entre 150 y 300 µm y una casi completa interconectividad. La gráfica obtenida con el biorreómetro muestra un comportamiento del soporte más elástico que viscoso, con una ocritica de 22 Pa. Se elaboró una gráfica con los pesos de los explantes de los soportes acelulares, mostrando una vida media de aproximadamente dos meses y una desaparición macroscópica del soporte a los cuatro meses de evolución. Subestudio ll. Se constató la rediferenciación morfológica de los condrocitos tras tres meses en medio de rediferenciación condrogénico. Sin embargo, no se observó producción de matriz extracelular. Subestudio lll: A los dos meses del implante subcutáneo, se observó cartílago maduro entre los poros del soporte. Este cartílago mostraba positividad en su matriz extracelular para colágeno tipo ll y glicosaminglicanos, pero no para elastina. Subestudio lV: El estudio de los sitios de implante de soportes acelulares mostró el relleno del defecto por tejido conectivo. Sin embargo, los sitios de implante de soportes con condrocitos aparecían rellenos por un material blanco y duro. El examen histológico de dicho material demostró la presencia de tejido cartilaginoso maduro junto con áreas de diferenciación ósea. En las muestras marcadas con GFP, aparecían marcadas las células del cartílago y las que estaban en las zonas de diferenciación ósea. Discusión: Frente a los métodos actuales de reconstrucción auricular, la ingeniería Tisular surge como una opción deseable por Ia capacidad de producir cartílago a costa de una morbilidad mínima. Para ello, aún no se ha encontrado un soporte celular ideal. El soporte desarrollado por el Centro Comunitario cumple muchas de las propiedades ideales para la producción de cartílago, siendo fácil de elaborar, teniendo una microestructura favorable y siendo posible su utilización autóloga. Utilizando la metodología de este trabajo, no se ha conseguido producir cartílago in vitro. Sin embargo la utilización de soportes sembrados con condrocitos como injertos libres en el dorso de conejos de Nueva Zelanda consigue producir tejido cartilaginoso maduro. La aplicación de estos injertos en defectos experimentales auriculares consigue su reparación con cartílago, observándose áreas de osificación asociadas a restos de soporte. El origen de esta osificación es desconocido, y puede limitar su aplicación clínica. Sin embargo una estrategia en dos tiempos, con un implante inicial en subcutáneo y un transplante eutópico posterior, puede evitar esa formación ectópica de hueso. Conclusiones: -El soporte desarrollado por el CCST y utilizado presenta características físicas y biocinéticas que lo hacen útil en estrategias de ingeniería Tisular de cartílago. -El soporte utilizado permite el cultivo y la rediferenciación do condrocitos in vitro, pero con el método utilizado no es posible producir cartílago in vitro. -Es posible producir cartílago in vivo de forma ectópica (tejido subcutáneo) mediante el uso de soportes sembrados con condrocitos. -Es posible reparar defectos experimentales en orejas utilizando soportes sembrados con condrocitos autólogos. Sin embargo, la producción ectópica de hueso, de etiología desconocida, limite el uso clínico de esta tecnología.