Desarrollo de inmunoensayos de flujo lateral cuantitativos: Aplicación a la determinación de vesículas extracelulares

Abstract

Durante la última década, ha habido una creciente tendencia dentro de la comunidad médica a diseñar pruebas de laboratorio de bajo coste, sencillas y portátiles para su aplicación en el punto de atención (sistemas point-of-care, POC). Estas pruebas de diagnóstico POC proporcionan información clínicamente relevante de manera rápida y fiable, sin necesidad de tratamientos previos de la muestra o de la realización de los análisis en un laboratorio clínico central. Los estudios realizados en esta Tesis Doctoral exploran la posibilidad de diseñar sistemas POC mejorados, basados en pruebas ELISA previamente desarrolladas. Los inmunoensayos de flujo lateral (LFIAs) se encuentran entre las plataformas POC más establecidas que se hayan aplicado con éxito en la práctica clínica. Estos sistemas son portátiles, de forma que el análisis puede realizarse en el punto de atención, la detección es rápida, con tiempos de análisis inferiores a 15 minutos, y sencilla, pudiendo llevarse a cabo por personal no experimentado. Sin embargo, su utilidad diagnóstica real se encuentra limitada por la necesidad de incrementar la sensibilidad y por la falta de sistemas de cuantificación. En esta Tesis, las necesidades de sensibilidad fueron abordadas por el empleo de diferentes estrategias de mejora de la señal, como cambios en la arquitectura del papel o el empleo de diferentes elementos de generación de la misma (nanopartículas de oro, carbón o magnéticas). Éstas últimas también permitieron la cuantificación basada en medidas de densidad óptica, magnéticas y reflectancia. La determinación del antígeno prostático específico (PSA), biomarcador de cáncer de próstata, fue elegido como sistema modelo en las etapas iniciales. Sin embargo, durante el tiempo de realización de este trabajo, las vesículas extracelulares (EVs) surgieron como una nueva clase de biomarcadores en varias enfermedades, entre ellas el cáncer y las enfermedades neurológicas. El conocimiento adquirido se aplicó al desarrollo, por vez primera, de LFIAs para la detección de EVs. Se espera que este trabajo sirva para acelerar la investigación sobre ese campo, con las consiguientes mejoras en diagnóstico y pronóstico. Por otra parte, la automatización de todos los pasos del análisis se exploró durante una estancia en la Dublin City University (Irlanda), lo que permitió examinar el potencial de las plataformas centrífugas de microfluidos, conocidas como laboratorio en un disco (Lab-on-a-disc), como un sistema POC totalmente integrado. Así, se trató de automatizar un ELISA para la detección de PSA, dejando solamente un paso manual para la introducción de la muestra. Las ventajas de este sistema son la eliminación de etapas tediosas de análisis, disminución de los volúmenes de reactivos y muestras y los tiempos de análisis. El primer capítulo de esta Tesis establece las bases de una nueva línea de investigación en el Grupo de Investigación de Inmunoelectroanálisis, centrada en el desarrollo de inmunoensayos de flujo lateral o inmunocromatográficos. El segundo capítulo trata del desarrollo de un LFIA para la detección de PSA con nanopartículas magnéticas como marca. Las tiras de flujo lateral son acopladas posteriormente a un lector magnético experimental. En el tercer capítulo se describen los estudios realizados en el Biomedical Diagnostics Institute (BDI) de Dublín. En este capítulo se detalla la fabricación de un ELISA en un disco. La sección final de esta Tesis está dedicada al desarrollo de LFIA para la determinación de vesículas extracelulares, que representan una fuente rica en nuevos biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de ciertas enfermedades. Con el fin de optimizar la plataforma, se exploró el empleo de diferentes marcas y de sistemas multidetección. El test desarrollado resultó útil para la detección de EVs procedentes de diferentes fuentes (plasma, orina, cultivos celulares, etc.). La cuantificación fue posible a través de medidas de reflectancia.