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Repositorio de la Universidad de Oviedo. > Producción Bibliográfica de UniOvi: RECOPILA > Tesis >

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10651/29303

Title: Aislamiento y desarrollo de bacterias lácticas capaces de hidrolizar los péptidos inmunotóxicos del gluten
Author(s): Álvarez Sieiro, Patricia
Advisor: Fernández García, María
Álvarez González, Miguel Ángel
Other authors: Ingeniería Química y Tecnología del Medio Ambiente, Departamento de
Keywords: Ingeniería química
Biotecnología alimentaria
Microbiología de alimentos
Issue date: 9-Jul-2014
Format extent: 249 p.
Abstract: La enfermedad celíaca (EC) es una enteropatía inflamatoria de carácter autoinmune, que se produce tras la ingestión de gluten en individuos genéticamente predispuestos. Actualmente representa una de las enfermedades genéticas más comunes, con una prevalencia de 1:100 personas a nivel mundial. Actualmente se conocen los principales péptidos del gluten responsables de la EC, son péptidos con un elevado porcentaje de residuos de prolina que les confieren una elevada resistencia a la proteólisis gastrointestinal, por lo que se acumulan en el lumen intestinal desencadenando la respuesta inmune. Entre ellos destaca un péptido de 33 aminoácidos (33-mer) proveniente de la ¿/ß-gliadina, conocido por ser el péptido más inmunotóxico del gluten. El único tratamiento disponible para la EC es seguir una estricta dieta libre de gluten durante toda la vida del paciente, por lo que es necesario y urgente el desarrollo de nuevas terapias alternativas o complementarias que mejoren la calidad de vida de los pacientes celiacos. Durante los últimos años, se han propuesto distintos tratamientos que se encuentran en diferentes fases de investigación. Entre ellos se encuentra la terapia enzimática oral, que se basa en la administración de enzimas específicos capaces de degradar los péptidos del gluten en el tracto gastrointestinal (TGI). Se propuso el uso del enzima prolil endopeptidasa de Myxococcus xanthus (PEPMx) y el de Sphingomonas capsulata (PEPSc) como candidatos para la hidrólisis de los péptidos inmunotóxicos del gluten, sin embargo estos microorganismos no pueden ser incluidos en alimentos. Dado que las bacterias del ácido láctico (BAL) son microorganismos reconocidos como seguros, que forman parte de nuestra alimentación y de nuestra microbiota intestinal, junto al hecho de que poseen un sistema proteolítico muy extenso y variado, en la presente Tesis Doctoral propusimos utilizar BAL que sean capaces de hidrolizar los péptidos inmunotóxicos del gluten en el TGI, como terapia alternativa de la EC. Con el fin de alcanzar dicho objetivo se han seguido dos estrategias diferentes, por un lado la búsqueda en nichos ecológicos variados de BAL silvestres capaces de hidrolizar el péptido 33-mer y por otro lado, la generación de BAL recombinantes que sinteticen PEP para hidrolizar los péptidos del gluten. I. Búsqueda de BAL capaces de degradar la gliadina y el péptido 33-mer En primer lugar, se desarrolló un medio de cultivo que contiene gliadina como única fuente de nitrógeno (AHG-M), que permitió seleccionar en muestras complejas bacterias capaces de hidrolizar la gliadina. Se seleccionaron aquellas bacterias capaces de formar un halo claro alrededor de la colonia debido a la degradación de la gliadina. A continuación, se identificaron y se tipificaron molecularmente obteniendo 29 cepas de BAL diferentes capaces de crecer y formar halo en AHG-M. Se analizó la resistencia de las 29 cepas seleccionadas a varios antibióticos mediante la técnica de microdilución en caldo. Con el objetivo identificar las posibles actividades enzimáticas implicadas en la hidrólisis de la gliadina, se cuantificaron varias actividades peptidasas específicas para la hidrólisis de residuos de prolina. A continuación, se evaluó la capacidad de las cepas seleccionadas para hidrolizar el péptido de 33-mer, obteniendo que 5 de las 29 cepas fueron capaces de degradar completamente el péptido en las condiciones ensayadas. Se seleccionaron las mejores candidatas y se evaluó su capacidad para sobrevivir al paso por las condiciones del TGI simuladas in vitro. Con el fin de identificar aquellas actividades que pudieran estar implicadas en la hidrólisis del péptido inmunotóxico, se secuenció el genoma de la mejor candidata. II. Generación de BAL recombinantes productoras de prolil endopeptidasa La segunda estrategia se basó en el desarrollo de BAL recombinantes que sinteticen PEP para hidrolizar los péptidos inmunotóxicos del gluten. A partir de la secuencia aminoacídica de la PEPMx y de la PEPSc se diseñaron genes sintéticos con el uso de codones adaptado al género Lactobacillus. En primer lugar se construyeron dos cepas recombinantes de Lactococcus lactis que expresan bajo el control del promotor inducible de la nisina los genes que codifican para los enzimas PEPMx y la PEPSc. Se optimizó la producción de PEP y se comprobó la hidrólisis del péptido de 33-mer. Por otro lado, mediante el uso de un sistema de integración de grado alimentario, se construyeron 4 cepas recombinantes de Lactobacillus casei que poseen el gen que codifica a la PEP integrado establemente en el cromosoma, bajo el control del promotor constitutivo del gen apf de Lactobacillus crispatus. Además, la fusión traduccional del péptido señal del gen apf en el extremo amino permitió la secreción de las proteínas al exterior celular. Mediante un proceso de depuración se eliminaron las marcas de resistencia y el ADN de grado no alimentario del plásmido, manteniendo el estatus de grado alimentario de todas las cepas. Se obtuvieron cuatro cepas recombinantes de L. casei, dos sintetizan la PEP de S. capsulata, una la produce en el interior celular mientras que otra la secreta al sobrenadante. Otras dos cepas de L. casei sintetizan la PEP de M. xanthus, de igual manera una la produce intracelularmente y otra la secreta al exterior celular. Se optimizó la producción de PEP y se evaluó la capacidad de hidrolizar el péptido de 33-mer, así como la capacidad de sobrevivir al a las condiciones del TGI simuladas in vitro y de continuar secretando el enzima de manera activa.
Embargo date: 2028-01-01
URI: http://hdl.handle.net/10651/29303
Local notes: DT(SE) 2014-143
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