Desarrollo de metodologías de cuantificación de compuestos orgánicos basadas en dilución isotópica en línea de carbono-13 y espectrometría de masas

Abstract

Las técnicas cromatográficas son, en la actualidad, las herramientas más potentes de las que dispone la química analítica cuando se pretenden analizar compuestos específicos presentes en mezclas complejas. Sin embargo, la mayoría de los sistemas de detección utilizados en cromatografía, requieren de la calibración previa de la señal mediante el uso de estándares específicos para cada analito de interés. Aparte del aumento en el coste y en el tiempo de análisis que supone la calibración instrumental, el continuo desarrollo de nuevos compuestos orgánicos por parte de las industrias química y farmacéutica hace que, en ocasiones, no se disponga comercialmente de los patrones de calibración necesarios para su cuantificación. Algunos sistemas de detección elementales, como el ICPMS, son capaces de generar una respuesta instrumental para un determinado elemento independiente de la especie química en que se encuentre, permitiendo utilizar un único patrón genérico para cuantificar varias especies que contengan dicho elemento en su estructura. Ésta notable característica puede verse mejorada mediante la adición en continuo de un isótopo enriquecido del elemento a determinar, técnica conocida como dilución isotópica en línea, ya que la medida relativa de la señal del elemento natural frente al enriquecido permite la corrección en tiempo real de la deriva instrumental debida a gradientes cromatográficos o a interferencias de matriz. Sin embargo, el uso de esta técnica está limitado al análisis de especies que contengan elementos detectables por ICPMS, es decir, cualquier elemento a excepción de C, H, N y O, lo cual supone una importante limitación de la técnica para el análisis de compuestos orgánicos. Por otra parte, las fuentes de ionización utilizadas habitualmente en el análisis de compuestos orgánicos, tales como la ionización electrónica o el electrospray, generan una respuesta variable en función del analito y por tanto, no permiten cuantificar mediante dilución isotópica en línea. En este contexto, la presente Tesis Doctoral se centró en el desarrollo de nuevas metodologías analíticas que permitan ampliar el campo de aplicación de la dilución isotópica en línea a la mayoría de compuestos orgánicos, y que puedan ejercer como sistemas de detección genéricos en cromatografía. La base de estas metodologías consistió en intercalar una reacción química, combustión u oxidación, entre el sistema cromatográfico y el espectrómetro de masas, de manera que todo compuesto orgánico, una vez que eluye, se transforma cuantitativamente en dióxido de carbono. De esta manera sólo se mide una única especie en el espectrómetro de masas y por tanto, se garantiza una respuesta independiente del compuesto sin importar la fuente de ionización utilizada. Mediante la adición en continuo de un compuesto enriquecido en carbono-13, el cual también será convertido cuantitativamente en CO2, en este caso enriquecido, se completa el desarrollo de un sistema de dilución isotópica en línea para la detección de carbono, elemento presente en todo compuesto orgánico. Dicho metodología se aplicó tanto en tanto a compuestos volátiles (usando Cromatografía de Gases) como a compuestos no volátiles (empleando FIA o HPLC): Desarrollo y evaluación de un sistema de cuantificación universal de compuestos orgánicos volátiles basado en cromatografía de gases-combustión-espectrometría de masas y dilución isotópica post-columna de 13C. Se modificó un instrumento GC-MS, implementando una interfase de combustión para la conversión de los analitos a CO2, un depósito presurizado para la adición de un flujo constante de trazador (13CO2 disuelto en helio) y una válvula de 6 vías que posibilitaba dirigir la salida de la columna bien hacia la interfase de combustión, o bien directamente a la fuente de ionización, permitiendo así utilizar el instrumento como un GC-MS convencional. Se evaluaron las características analíticas del método mediante el análisis de diferentes hidrocarburos volátiles, y se demostró que la respuesta instrumental es independiente de la especie. Se evaluó la aplicabilidad a muestras complejas mediante el análisis de un gasóleo y se demostró la utilidad de la metodología en la evaluación de técnicas de extracción y pre-concentración para el caso concreto de la micro-extracción en fase sólida. Desarrollo de un sistema de cuantificación genérico de compuestos orgánicos solubles en agua, basado en FIA/HPLC-oxidación-MS y dilución isotópica en línea de 13C. En primer lugar se desarrolló y validó un sencillo sistema FIA para la cuantificación de CO2 en disolución acuosa, mediante dilución isotópica en línea, simplemente tras la acidificación en línea del agua y extracción del CO2 formado mediante una membrana permeable a este gas. Posteriormente, se utilizó un instrumento comercial de LC-IRMS que consta de una interfase que permite la oxidación en línea de compuestos orgánicos. Se optimizaron las condiciones de trabajo para para lograr oxidar de forma completa distintos tipos de compuestos orgánicos y se aplicó a la cuantificación de distintas sustancias puras y mezclas sencillas de patrones mediante FIA y cromatografía líquida, respectivamente. La metodología se validó en primer lugar para la determinación de pureza de compuestos orgánicos polares de baja complejidad estructural mediante la participación en el estudio de intercomparación P117-c, ¿Evaluación de la pureza de l-Valina¿ organizado por el CCQM (Comité Consultatif pour la Quantité de Matiére). Posteriormente se demostró y validó su uso potencial para la determinación directa de la pureza en masa de estándares de péptidos mediante el análisis de distintos péptidos sintéticos comparando con resultados obtenidos por distintas técnicas (AAA, ICPMS), y la medida del material de referencia NIST RM8327.