Caracterización de la RNA polimerasa dependiente de RNA del virus de la enfermedad hemorragica del conejo

Abstract

La región codificadora de la rna polimerasa dependiente de rna del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo(rhdv) (aislado ast/89) se expresó en escherichia coli mediante la utilización de un vector basado en la glutation s-transferasa, lo cual permitió obtener miligramos de proteína homogénea de 58 kda, que se correspondía con la masa molecular esperada. El polipéptido recombinante era activo como poli(u) polimerasa dependiente de poli(a) y oligo(u), actividad que resistía el tratamiento con los antibióticos rifampicina y actinomicinad y era específica de substrato. El enzima actuaba como rna polimerasa en reacciones in vitro utilizando como molde un rna sintético de secuencia idéntica a la del rna subgenómico del rhdv en presencia o ausencia de un cebador oligo(u). Esta actividad también era resistente a ambos antibióticos. En las reacciones cebadas por oligo(u) se sintetizaban productos del tamaño del molde, mientras que en ausencia de cebador se formaban productos de rna cuya longitud era doble con respecto a la del molde. Los rnas de doble tamaño eranbicatenarios e hibridaban con sondas de polaridad positiva y negativa. La estructura de estos productos se caracterizó utiliando un molde bloqueado en su extremo 3' y se propone una hipótesis para el mecanismo de su formación, meiante cebado en el grupo hidroxilo 3'dpol del rhdv, se empleó una aproximación experimental mediante mutagénesis sitio-dirigida, centrada en la secuencia aminoacídica altamente conservada gdd. Cada uno de los residuos de aspartato del motivo se sustitutyó por glicina, glutamato o asparragina. Las seis proteínas mutantes se produjeron en e. Coli y sus actividades se midieron mediante un ensayo poli(u) polimerasa dependiente de poli(a). Los resultados demuestran la implicación de ambos aspartatos en la interacción con metales que ocurre durante el proceso catalítico.#